Fluidigm CyTOF質(zhì)譜流式技術(shù)CAR-T細胞療法治愈白血病？

發(fā)布時間：

2022-02-23

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在接受治療超過十年之后，兩人體內(nèi)均一直未再檢測到白血病跡象，Carl June教授表示，現(xiàn)在可以認為CAR-T確實可以真正治愈白血病

　　去年，關(guān)于120萬一針的CAR-T天價療法的新聞傳遍大江南北。而付出如此昂貴的代價，白血病又是否得以真正治愈呢？近日，新浪、騰訊、搜狐等多家媒體紛紛報道，美國CAR-T之父Carl June教授在著名期刊《Nature》發(fā)表最新論文，詳細介紹了世界第一位接受CAR-T治療的患者 Bill Ludwig和第二位接受CAR-T治療的 Doug Olson的治療結(jié)果。在接受治療超過十年之后，兩人體內(nèi)均一直未再檢測到白血病跡象，Carl June教授表示，現(xiàn)在可以認為CAR-T確實可以真正治愈白血病。（推薦閱讀：人B淋巴細胞、EBV-轉(zhuǎn)化人淋巴細胞、1301人淋巴細胞）
　　在這項研究中，Carl June實驗室應(yīng)用了Fluidigm CyTOF質(zhì)譜流式技術(shù)，對CAR-T細胞的表型和功能進行了深入且長期的追蹤研究。以下，我們就為您就這項研究成果做詳細介紹。
　　CAR-T療法，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是將患者的T淋巴細胞（具有天然抗感染和抗癌作用）分離出來，通過基因重新編輯讓T淋巴細胞帶上能夠識別腫瘤細胞抗原的受體，并進行大規(guī)模的體外擴增CAR-T細胞，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，CAR-T細胞便會特異性地攻擊腫瘤細胞，從而快速、精準(zhǔn)地治療腫瘤。CAR-T療法在多種癌癥中顯示了治療潛力。然而，對輸入體內(nèi)的CAR-T細胞的長期潛力和克隆穩(wěn)定性知之甚少。（推薦閱讀：CCRF-CEM人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞、GM12878人B淋巴細胞、IM-9人外周血B淋巴細胞）
　　2022年2月2日，賓夕法尼亞大學(xué)&費城兒童醫(yī)院的研究人員在 Nature雜志在線發(fā)表了題為Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells的文章【1】，并受到了廣泛的關(guān)注。作者利用Fluidigm質(zhì)譜流式技術(shù)（CyTOF）和CITE-seq等多組學(xué)技術(shù)深入分析了CAR-T治療不同階段患者體內(nèi)的CAR-T細胞特性和變化，首次揭示了長期持久CAR-T細胞的特征。
　　作者利用質(zhì)譜流式，設(shè)計了由40個markers組成的panel，其中35個marker（表面和胞內(nèi)）用于識別T細胞, 另外5個marker用于去除非T細胞。對兩位十年前首批接受CAR-T治療后獲得完全緩解的慢性淋巴細胞白血病患者進行跟蹤檢測。
　　患者1中，CAR-T輸入后1.8個月，CD8+CAR-T細胞占比29.3%，在隨后的時間點出現(xiàn)比例下降；CAR-T細胞輸入后1.4年，CD4+ CAR-T細胞占比97.5%；CAR-T細胞輸入后3.4年到9.3年；CD4+ CAR-T細胞占比99.6%(圖1a-c)。患者2中，以更加延遲的CAR T細胞擴增為特征，并表現(xiàn)整體相似的趨勢。CD8+CAR-T在初始時間點為主要的亞群，隨后逐漸減少，CAR-T細胞輸入后7.2年，CD4+CAR-T細胞占比97.6%。同時發(fā)現(xiàn)CD4-CD8-CAR-T細胞亞群在患者2中很明顯，CAR-T細胞輸入后2.5個月和1.6年，分別占總CAR-T細胞的33.4%和46.5%；CAR-T細胞輸入后2.8年、4.7年和7.2年，分別減少到12.9%、8.2%和0.5%(圖1b, c)。該細胞亞群有著獨特的細胞表型，表達細胞毒性標(biāo)記物GZMB, 2B4，CD57, CD85j，T-bet和PD-1，以及Helios（Helios--T細胞活化和增殖的一種標(biāo)志物-編者注【2】）。這些特征明顯地將該亞群與其他類似的細胞毒性CD8+ T細胞區(qū)分開(圖1b)。基于這種獨特的標(biāo)記，作者將其標(biāo)記為CD4-CD8- Helioshi CAR-T細胞。該亞群在患者1輸入CAR-T細胞1.8月的樣本中比率較低(3.2%)，并在CAR-T細胞輸入后1.4年變得更少(小于1%)(圖1c)。

　　圖1.質(zhì)譜流式多個時間點分析CD3+ CAR-T細胞。a. UMP降維分析患者不同時間點的CD3+ CAR-T細胞，顏色代表采樣時間點；b. 選定細胞標(biāo)記物的蛋白表達； c. UMAP降維展示5個主要的CAR - T細胞群組成，顏色代表細胞亞群；d. 統(tǒng)計分析不同細胞中Ki67的表達；e. CAR - T細胞亞群中各標(biāo)記物表達的熱圖。
　　CD4+ CAR-T細胞高表達Ki67，為增殖表型(圖1b)。在兩例患者中，Ki67hiCD4+ CAR-T細胞穩(wěn)步出現(xiàn)。患者1中，CAR-T細胞輸入后1.8個月時占總CAR-T細胞的15.9%；CAR-T輸入后9.3年增加到97.0%。患者2中，Ki67hi CD4+ CAR-T細胞在CAR-T細胞輸入后2.4個月時占0.2%， CAR-T細胞輸入后7.2年增加到87.2%(圖1b, c)。比較CAR+ CD4 T細胞和CAR- CD4 T細胞，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達具有很強的CAR+ T細胞特異性(圖1d)。CD8+ CAR-T細胞整體上也表現(xiàn)出增殖趨勢，但是Ki67的表達普遍較CD4+ CAR-T細胞低且不穩(wěn)定(圖1d)。且Ki67hi CD4+T細胞表達了不同的標(biāo)志物，包括激活標(biāo)志物CD38、HLA-DR和CD95、轉(zhuǎn)錄因子EOMES和TOX、檢查點標(biāo)志物CTLA-4, LAG-3和TIGIT，以及記憶型標(biāo)志物CD27和CCR7(圖1e)。
　　綜上結(jié)果表明兩名患者體內(nèi)的CAR-T細胞治療經(jīng)歷了兩個不同的階段，初始階段以CD8+CAR-T和CD4-CD8- CAR-T細胞為主，負責(zé)殺傷腫瘤細胞，而長期緩解階段則以CD4+CAR-T細胞為主，負責(zé)控制腫瘤細胞，且CD4+CAR-T細胞表現(xiàn)出持續(xù)增殖和殺傷腫瘤細胞的特性，是持久臨床反應(yīng)的關(guān)鍵特征。想要長久控制腫瘤，也需要多種不同CAR-T細胞類型的組合。此項研究為與抗癌反應(yīng)和長期緩解相關(guān)的CAR-T細胞特征提供了新的見解，且為CAR-T細胞療法的長期治療效果和整合到體內(nèi)的安全性提供了概念證明。Carl June表示，現(xiàn)在可以認為CAR-T確實可以真正治愈白血病。
　　這項研究成功地運用了CyTOF技術(shù)，對患者體內(nèi)CAR-T細胞表型和功能進行深入而細致的分析。Fluidigm公司獨有的質(zhì)譜流式技術(shù)是一種高通量單細胞蛋白質(zhì)分析技術(shù)，利用金屬元素作為抗體的標(biāo)簽，以質(zhì)譜作為檢測手段，可同時分析單細胞表面和內(nèi)部的50多種標(biāo)志物，由于采用特殊的金屬元素作為檢測信號，背景信號極低，徹底解決傳統(tǒng)流式的熒光串色的問題，并在多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
　　參考文獻：
　　1 Melenhorst J. J.,Chen G. M., Wang M. et al. "Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells." Nature. 2022 Feb 2. doi: 10.1038/s41586-021-04390-6.
　　2 Tatiana Akimova, Ulf H Beier, Liqing Wang, et al. "Helios expression is a marker of T cell activation and proliferation" PLoS One2011;6(8):e24226. doi: 10.1371/journal.pone.0024226. Epub2011 Aug 30.