Fluidigm CyTOF質(zhì)譜流式技術(shù)CAR-T細(xì)胞療法治愈白血病？

發(fā)布時(shí)間：

2022-02-23

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在接受治療超過(guò)十年之后，兩人體內(nèi)均一直未再檢測(cè)到白血病跡象，Carl June教授表示，現(xiàn)在可以認(rèn)為CAR-T確實(shí)可以真正治愈白血病

　　去年，關(guān)于120萬(wàn)一針的CAR-T天價(jià)療法的新聞傳遍大江南北。而付出如此昂貴的代價(jià)，白血病又是否得以真正治愈呢？近日，新浪、騰訊、搜狐等多家媒體紛紛報(bào)道，美國(guó)CAR-T之父Carl June教授在著名期刊《Nature》發(fā)表最新論文，詳細(xì)介紹了世界第一位接受CAR-T治療的患者 Bill Ludwig和第二位接受CAR-T治療的 Doug Olson的治療結(jié)果。在接受治療超過(guò)十年之后，兩人體內(nèi)均一直未再檢測(cè)到白血病跡象，Carl June教授表示，現(xiàn)在可以認(rèn)為CAR-T確實(shí)可以真正治愈白血病。（推薦閱讀：人B淋巴細(xì)胞、EBV-轉(zhuǎn)化人淋巴細(xì)胞、1301人淋巴細(xì)胞）
　　在這項(xiàng)研究中，Carl June實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用了Fluidigm CyTOF質(zhì)譜流式技術(shù)，對(duì)CAR-T細(xì)胞的表型和功能進(jìn)行了深入且長(zhǎng)期的追蹤研究。以下，我們就為您就這項(xiàng)研究成果做詳細(xì)介紹。
　　CAR-T療法，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，是將患者的T淋巴細(xì)胞（具有天然抗感染和抗癌作用）分離出來(lái)，通過(guò)基因重新編輯讓T淋巴細(xì)胞帶上能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞抗原的受體，并進(jìn)行大規(guī)模的體外擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，CAR-T細(xì)胞便會(huì)特異性地攻擊腫瘤細(xì)胞，從而快速、精準(zhǔn)地治療腫瘤。CAR-T療法在多種癌癥中顯示了治療潛力。然而，對(duì)輸入體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞的長(zhǎng)期潛力和克隆穩(wěn)定性知之甚少。（推薦閱讀：CCRF-CEM人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞、GM12878人B淋巴細(xì)胞、IM-9人外周血B淋巴細(xì)胞）
　　2022年2月2日，賓夕法尼亞大學(xué)&費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員在 Nature雜志在線發(fā)表了題為Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells的文章【1】，并受到了廣泛的關(guān)注。作者利用Fluidigm質(zhì)譜流式技術(shù)（CyTOF）和CITE-seq等多組學(xué)技術(shù)深入分析了CAR-T治療不同階段患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞特性和變化，首次揭示了長(zhǎng)期持久CAR-T細(xì)胞的特征。
　　作者利用質(zhì)譜流式，設(shè)計(jì)了由40個(gè)markers組成的panel，其中35個(gè)marker（表面和胞內(nèi)）用于識(shí)別T細(xì)胞, 另外5個(gè)marker用于去除非T細(xì)胞。對(duì)兩位十年前首批接受CAR-T治療后獲得完全緩解的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。
　　患者1中，CAR-T輸入后1.8個(gè)月，CD8+CAR-T細(xì)胞占比29.3%，在隨后的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)比例下降；CAR-T細(xì)胞輸入后1.4年，CD4+ CAR-T細(xì)胞占比97.5%；CAR-T細(xì)胞輸入后3.4年到9.3年；CD4+ CAR-T細(xì)胞占比99.6%(圖1a-c)。患者2中，以更加延遲的CAR T細(xì)胞擴(kuò)增為特征，并表現(xiàn)整體相似的趨勢(shì)。CD8+CAR-T在初始時(shí)間點(diǎn)為主要的亞群，隨后逐漸減少，CAR-T細(xì)胞輸入后7.2年，CD4+CAR-T細(xì)胞占比97.6%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD4-CD8-CAR-T細(xì)胞亞群在患者2中很明顯，CAR-T細(xì)胞輸入后2.5個(gè)月和1.6年，分別占總CAR-T細(xì)胞的33.4%和46.5%；CAR-T細(xì)胞輸入后2.8年、4.7年和7.2年，分別減少到12.9%、8.2%和0.5%(圖1b, c)。該細(xì)胞亞群有著獨(dú)特的細(xì)胞表型，表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)記物GZMB, 2B4，CD57, CD85j，T-bet和PD-1，以及Helios（Helios--T細(xì)胞活化和增殖的一種標(biāo)志物-編者注【2】）。這些特征明顯地將該亞群與其他類似的細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞區(qū)分開(kāi)(圖1b)。基于這種獨(dú)特的標(biāo)記，作者將其標(biāo)記為CD4-CD8- Helioshi CAR-T細(xì)胞。該亞群在患者1輸入CAR-T細(xì)胞1.8月的樣本中比率較低(3.2%)，并在CAR-T細(xì)胞輸入后1.4年變得更少(小于1%)(圖1c)。

　　圖1.質(zhì)譜流式多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析CD3+ CAR-T細(xì)胞。a. UMP降維分析患者不同時(shí)間點(diǎn)的CD3+ CAR-T細(xì)胞，顏色代表采樣時(shí)間點(diǎn)；b. 選定細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白表達(dá)； c. UMAP降維展示5個(gè)主要的CAR - T細(xì)胞群組成，顏色代表細(xì)胞亞群；d. 統(tǒng)計(jì)分析不同細(xì)胞中Ki67的表達(dá)；e. CAR - T細(xì)胞亞群中各標(biāo)記物表達(dá)的熱圖。
　　CD4+ CAR-T細(xì)胞高表達(dá)Ki67，為增殖表型(圖1b)。在兩例患者中，Ki67hiCD4+ CAR-T細(xì)胞穩(wěn)步出現(xiàn)。患者1中，CAR-T細(xì)胞輸入后1.8個(gè)月時(shí)占總CAR-T細(xì)胞的15.9%；CAR-T輸入后9.3年增加到97.0%。患者2中，Ki67hi CD4+ CAR-T細(xì)胞在CAR-T細(xì)胞輸入后2.4個(gè)月時(shí)占0.2%， CAR-T細(xì)胞輸入后7.2年增加到87.2%(圖1b, c)。比較CAR+ CD4 T細(xì)胞和CAR- CD4 T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)具有很強(qiáng)的CAR+ T細(xì)胞特異性(圖1d)。CD8+ CAR-T細(xì)胞整體上也表現(xiàn)出增殖趨勢(shì)，但是Ki67的表達(dá)普遍較CD4+ CAR-T細(xì)胞低且不穩(wěn)定(圖1d)。且Ki67hi CD4+T細(xì)胞表達(dá)了不同的標(biāo)志物，包括激活標(biāo)志物CD38、HLA-DR和CD95、轉(zhuǎn)錄因子EOMES和TOX、檢查點(diǎn)標(biāo)志物CTLA-4, LAG-3和TIGIT，以及記憶型標(biāo)志物CD27和CCR7(圖1e)。
　　綜上結(jié)果表明兩名患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞治療經(jīng)歷了兩個(gè)不同的階段，初始階段以CD8+CAR-T和CD4-CD8- CAR-T細(xì)胞為主，負(fù)責(zé)殺傷腫瘤細(xì)胞，而長(zhǎng)期緩解階段則以CD4+CAR-T細(xì)胞為主，負(fù)責(zé)控制腫瘤細(xì)胞，且CD4+CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出持續(xù)增殖和殺傷腫瘤細(xì)胞的特性，是持久臨床反應(yīng)的關(guān)鍵特征。想要長(zhǎng)久控制腫瘤，也需要多種不同CAR-T細(xì)胞類型的組合。此項(xiàng)研究為與抗癌反應(yīng)和長(zhǎng)期緩解相關(guān)的CAR-T細(xì)胞特征提供了新的見(jiàn)解，且為CAR-T細(xì)胞療法的長(zhǎng)期治療效果和整合到體內(nèi)的安全性提供了概念證明。Carl June表示，現(xiàn)在可以認(rèn)為CAR-T確實(shí)可以真正治愈白血病。
　　這項(xiàng)研究成功地運(yùn)用了CyTOF技術(shù)，對(duì)患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞表型和功能進(jìn)行深入而細(xì)致的分析。Fluidigm公司獨(dú)有的質(zhì)譜流式技術(shù)是一種高通量單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析技術(shù)，利用金屬元素作為抗體的標(biāo)簽，以質(zhì)譜作為檢測(cè)手段，可同時(shí)分析單細(xì)胞表面和內(nèi)部的50多種標(biāo)志物，由于采用特殊的金屬元素作為檢測(cè)信號(hào)，背景信號(hào)極低，徹底解決傳統(tǒng)流式的熒光串色的問(wèn)題，并在多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
　　參考文獻(xiàn)：
　　1 Melenhorst J. J.,Chen G. M., Wang M. et al. "Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells." Nature. 2022 Feb 2. doi: 10.1038/s41586-021-04390-6.
　　2 Tatiana Akimova, Ulf H Beier, Liqing Wang, et al. "Helios expression is a marker of T cell activation and proliferation" PLoS One2011;6(8):e24226. doi: 10.1371/journal.pone.0024226. Epub2011 Aug 30.