阻斷ERK途徑有效地抑制光誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬應(yīng)用與價(jià)值

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2022-03-29

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661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞是光感受器細(xì)胞很好的替代細(xì)胞，我們以661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究發(fā)現(xiàn):2600Lux可見光照射可以誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，而抑制自噬可以有效地保護(hù)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞免受損害

　　前言
　　過強(qiáng)的光或長時(shí)間直視光源會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成的一定程度的損害，稱為視網(wǎng)膜光損傷。不同波長的光對(duì)視網(wǎng)膜組織的損傷機(jī)制不同，主要有熱損傷、機(jī)械損傷和光化學(xué)損傷，其中光化學(xué)損傷是最常見的類型。特別隨著手機(jī)、電腦等電子產(chǎn)品的廣泛普及和眼科光學(xué)診療器械應(yīng)用日漸增多，各種光源所致的視網(wǎng)膜損傷問題愈發(fā)引起人們的注意。此外，視網(wǎng)膜光損傷的病理過程與年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性等難治性眼底疾病有許多相似之處，視網(wǎng)膜光損傷會(huì)造成感光細(xì)胞的損傷、凋亡、生物膜溶解和細(xì)胞壞死，引發(fā)眼病，甚至導(dǎo)致視力喪失。目前對(duì)視網(wǎng)膜光損傷機(jī)制的探討尚有待于進(jìn)一步深入，而且至今尚無有效的治療方法。
　　自噬是真核細(xì)胞生物一種保守的降解并回收胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器的過程，自噬與凋亡相互作用，共同完成細(xì)胞程序性死亡的進(jìn)程。自噬是否可以引起視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的光損傷，其作用機(jī)制和途徑如何，是本實(shí)驗(yàn)研究的著眼點(diǎn)。661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞是光感受器細(xì)胞很好的替代細(xì)胞，我們以661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究發(fā)現(xiàn):2600Lux可見光照射可以誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，而抑制自噬可以有效地保護(hù)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞免受損害，E1ZK信號(hào)途徑的活化是光致661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡的關(guān)鍵。這些研究結(jié)論使我們對(duì)于視網(wǎng)膜光損傷相關(guān)疾病中感光細(xì)胞死亡的分子機(jī)制有了更為清晰的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步尋求一種理想的治療方法提供了新的思路。
　　摘要
　　抑制自噬在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞光損傷中的保護(hù)作用自噬是一種保守的細(xì)胞自我退化的過程，在細(xì)胞生長關(guān)鍵時(shí)期如發(fā)育階段或營養(yǎng)缺乏時(shí)常常對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。然而，有時(shí)自噬也參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程。光感受器細(xì)胞是唯一直接暴露在光照下將光刺激轉(zhuǎn)換為視覺信號(hào)的神經(jīng)元細(xì)胞。但過強(qiáng)的光照射對(duì)視網(wǎng)膜仍具有細(xì)胞毒性作用。至今為止，視網(wǎng)膜光損傷的確切機(jī)制尚不明確，并且臨床上仍無有效治療方案，特別是自噬在光誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
　　1.光照對(duì)誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞產(chǎn)生自噬的作用
　　目的:
　　通過不同的自噬檢測方法，觀察2600Lux可見光照射對(duì)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞自噬的影響。
　　方法:
　　(1)利用2600Lux可見光處理傳代培養(yǎng)后的661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞株，建立光感受器細(xì)胞光損傷動(dòng)物模型。
　　(2)利用western
　　blotting檢測分析自噬標(biāo)志性蛋白LC3在細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及利用電子顯微鏡對(duì)自噬體形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀察。
　　(3)應(yīng)用3-MA和LY294002兩種不同的自噬抑制劑對(duì)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，通過PI染色進(jìn)行細(xì)胞死亡百分比定量評(píng)估，觀察抑制自噬對(duì)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞光損傷保護(hù)作用的影響。
　　結(jié)果
　?。?)在光強(qiáng)度26001ux照射1-2d的661 W
　　細(xì)胞中LC3II表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中LC3II / LC3I的比例明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0.001)。經(jīng)過2天光照后，661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞表現(xiàn)出典型的自噬特性，一些胞內(nèi)物質(zhì)如細(xì)胞器被包繞在雙層膜囊內(nèi)，成為自噬小體。
　　(2)應(yīng)用10 - 30}M的LY294002光照前30分鐘對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，細(xì)胞死亡比例從63%下降至20%,其最佳濃度在20}.M左右;661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞與2.5-7.SmM的3-MA預(yù)孵化，細(xì)胞死亡率從63%減少至30，在5 mM顯示出最好的保護(hù)作用。
　　其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0.001)。結(jié)論:光照是誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵，而且阻斷自噬可以有效地保護(hù)感光細(xì)胞免受損害。
　　2. MAPK信號(hào)途徑對(duì)光誘導(dǎo)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞自噬的影響
　　目的:
　　研究在2600Lux可見光照射條件下，MAPK信號(hào)途徑對(duì)661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞活性的影響，探討自噬在光誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)利用2600Lux可見光處理傳代培養(yǎng)后的661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞株，建立光感受器細(xì)胞光損傷模型。
　?。?)利用Western blotting檢測ERKJ磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達(dá)水平，通過PI染色對(duì)ERK抑制劑PD980519, JNK抑制劑SP600125和P38抑制劑SB203580預(yù)處理后的“1W細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡百分比定量評(píng)估。
　　(3)在指定時(shí)間內(nèi)收集細(xì)胞裂解，利用Western blotting檢測ERK和磷酸化ERK后LC3II和LC3I表達(dá)水平的變化，以及通過LysoTracker染色觀察自噬小體內(nèi)溶酶體生成情況。
　　結(jié)果：
　?。?)收集細(xì)胞裂解，對(duì)ERK/磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達(dá)水平進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，實(shí)驗(yàn)組(磷酸化組)掃描蛋白條帶光密度測量強(qiáng)度明顯增加，對(duì)照組(非磷酸化)只略有增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。用40-80}.M的PD980519對(duì)細(xì)進(jìn)行預(yù)處理，光誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡比例從61%減少至約30 0，而SP600125或SB203580對(duì)細(xì)胞免受光損傷的保護(hù)作用效果不顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001) o
　?。?)通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，用40}M PD980519在光照30分鐘前處理細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)了P-ERK和ERK的上調(diào)。定量分析結(jié)果表明，在PD980519預(yù)處理組非磷酸化和磷酸化形式的ERK水平均顯著減少。而且光照2天后用40}.M PD980519處理組降低了LC3II/ LC3I比率的上調(diào)。通過Lyso Tracker染色發(fā)現(xiàn):用40}MPD980519預(yù)處理即使在光照下也明顯抑制了細(xì)胞溶酶體的形成。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0.001)。
　　結(jié)論:
　　可見光照射可以激活活化蛋白酶< MAPK)通路導(dǎo)致661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬，在激活的MAPK信號(hào)下游通路中，是ERK通路而不是JNK或P-3 8在光誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過阻斷ERK途徑能有效地抑制光誘導(dǎo)的661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　本研究的發(fā)現(xiàn)可能在視網(wǎng)膜光損傷的治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　關(guān)鍵詞:
　　視網(wǎng)膜光損傷，細(xì)胞自噬，神經(jīng)保護(hù)，感光細(xì)胞，ERK