阻斷ERK途徑有效地抑制光誘導661W小鼠視網膜感光細胞發生自噬應用與價值
發布時間：
2022-03-29
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前言
過強的光或長時間直視光源會對視網膜造成的一定程度的損害，稱為視網膜光損傷。不同波長的光對視網膜組織的損傷機制不同，主要有熱損傷、機械損傷和光化學損傷，其中光化學損傷是最常見的類型。特別隨著手機、電腦等電子產品的廣泛普及和眼科光學診療器械應用日漸增多，各種光源所致的視網膜損傷問題愈發引起人們的注意。此外，視網膜光損傷的病理過程與年齡相關性黃斑變性、視網膜色素變性等難治性眼底疾病有許多相似之處，視網膜光損傷會造成感光細胞的損傷、凋亡、生物膜溶解和細胞壞死，引發眼病，甚至導致視力喪失。目前對視網膜光損傷機制的探討尚有待于進一步深入，而且至今尚無有效的治療方法。
自噬是真核細胞生物一種保守的降解并回收胞質內蛋白質或受損細胞器的過程，自噬與凋亡相互作用，共同完成細胞程序性死亡的進程。自噬是否可以引起視網膜感光細胞的光損傷，其作用機制和途徑如何，是本實驗研究的著眼點。661W小鼠視網膜感光細胞是光感受器細胞很好的替代細胞，我們以661W小鼠視網膜感光細胞為實驗動物模型，研究發現:2600Lux可見光照射可以誘導661W小鼠視網膜感光細胞發生自噬現象，而抑制自噬可以有效地保護661W小鼠視網膜感光細胞免受損害，E1ZK信號途徑的活化是光致661W小鼠視網膜感光細胞死亡的關鍵。這些研究結論使我們對于視網膜光損傷相關疾病中感光細胞死亡的分子機制有了更為清晰的認識，為進一步尋求一種理想的治療方法提供了新的思路。
摘要
抑制自噬在視網膜光感受器細胞光損傷中的保護作用自噬是一種保守的細胞自我退化的過程，在細胞生長關鍵時期如發育階段或營養缺乏時常常對細胞發揮保護作用。然而，有時自噬也參與細胞凋亡進程。光感受器細胞是唯一直接暴露在光照下將光刺激轉換為視覺信號的神經元細胞。但過強的光照射對視網膜仍具有細胞毒性作用。至今為止，視網膜光損傷的確切機制尚不明確，并且臨床上仍無有效治療方案，特別是自噬在光誘導感光細胞凋亡中的作用機制有待進一步探討。
1.光照對誘導661W小鼠視網膜感光細胞產生自噬的作用
目的:
通過不同的自噬檢測方法，觀察2600Lux可見光照射對661W小鼠視網膜感光細胞自噬的影響。
方法:
(1)利用2600Lux可見光處理傳代培養后的661W小鼠視網膜感光細胞株，建立光感受器細胞光損傷動物模型。
(2)利用western
blotting檢測分析自噬標志性蛋白LC3在細胞中的表達水平，以及利用電子顯微鏡對自噬體形態學變化進行觀察。
(3)應用3-MA和LY294002兩種不同的自噬抑制劑對661W小鼠視網膜感光細胞進行預處理后，通過PI染色進行細胞死亡百分比定量評估，觀察抑制自噬對661W小鼠視網膜感光細胞光損傷保護作用的影響。
結果
（1)在光強度26001ux照射1-2d的661 W
細胞中LC3II表達水平明顯增強，實驗組細胞中LC3II / LC3I的比例明顯高于對照組細胞，其差異有統計學意義((P<0.001)。經過2天光照后，661W小鼠視網膜感光細胞表現出典型的自噬特性，一些胞內物質如細胞器被包繞在雙層膜囊內，成為自噬小體。
(2)應用10 - 30}M的LY294002光照前30分鐘對細胞進行預處理，細胞死亡比例從63%下降至20%,其最佳濃度在20}.M左右;661W小鼠視網膜感光細胞與2.5-7.SmM的3-MA預孵化，細胞死亡率從63%減少至30，在5 mM顯示出最好的保護作用。
其差異有統計學意義((P<0.001)。結論:光照是誘導661W小鼠視網膜感光細胞發生自噬的關鍵，而且阻斷自噬可以有效地保護感光細胞免受損害。
2. MAPK信號途徑對光誘導661W小鼠視網膜感光細胞自噬的影響
目的:
研究在2600Lux可見光照射條件下，MAPK信號途徑對661W小鼠視網膜感光細胞活性的影響，探討自噬在光誘導感光細胞凋亡中的作用機制。
方法:
(1)利用2600Lux可見光處理傳代培養后的661W小鼠視網膜感光細胞株，建立光感受器細胞光損傷模型。
（2)利用Western blotting檢測ERKJ磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達水平，通過PI染色對ERK抑制劑PD980519, JNK抑制劑SP600125和P38抑制劑SB203580預處理后的“1W細胞進行細胞死亡百分比定量評估。
(3)在指定時間內收集細胞裂解，利用Western blotting檢測ERK和磷酸化ERK后LC3II和LC3I表達水平的變化，以及通過LysoTracker染色觀察自噬小體內溶酶體生成情況。
結果：
（1)收集細胞裂解，對ERK/磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表達水平進行蛋白免疫印跡分析，實驗組(磷酸化組)掃描蛋白條帶光密度測量強度明顯增加，對照組(非磷酸化)只略有增加，其差異有統計學意義(P<0.001)。用40-80}.M的PD980519對細進行預處理，光誘導的細胞死亡比例從61%減少至約30 0，而SP600125或SB203580對細胞免受光損傷的保護作用效果不顯著，差異有統計學意義(P<0.001) o
（2)通過Western blot檢測發現，用40}M PD980519在光照30分鐘前處理細胞，逆轉了P-ERK和ERK的上調。定量分析結果表明，在PD980519預處理組非磷酸化和磷酸化形式的ERK水平均顯著減少。而且光照2天后用40}.M PD980519處理組降低了LC3II/ LC3I比率的上調。通過Lyso Tracker染色發現:用40}MPD980519預處理即使在光照下也明顯抑制了細胞溶酶體的形成。差異均具有統計學意義((P<0.001)。
結論:
可見光照射可以激活活化蛋白酶< MAPK)通路導致661W小鼠視網膜感光細胞發生自噬，在激活的MAPK信號下游通路中，是ERK通路而不是JNK或P-3 8在光誘導的細胞死亡機制中發揮了關鍵作用。通過阻斷ERK途徑能有效地抑制光誘導的661W小鼠視網膜感光細胞發生自噬。
本研究的發現可能在視網膜光損傷的治療中具有潛在應用價值。
關鍵詞:
視網膜光損傷，細胞自噬，神經保護，感光細胞，ERK
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