搞不清楚病毒載體的用法？這里整理了詳細(xì)的資料（建議收藏閱讀）
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2021-12-13
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基因表達(dá)載體是廣大科研人員普遍需要的研究工具，而病毒載體憑借其優(yōu)良效能則越來(lái)越成為最受歡迎、也最為普遍的基因表達(dá)載體。然而病毒載體也分為好幾類(lèi)，不同實(shí)驗(yàn)類(lèi)型、不同研究目的、不同“受體”性質(zhì)需要我們準(zhǔn)確評(píng)估與選擇。因此，詳細(xì)了解不同病毒載體的相關(guān)知識(shí)是我們科研人員必須掌握的。本文詳細(xì)介紹了常見(jiàn)病毒載體的原理、特點(diǎn)和適用范圍。
一、慢病毒載體
慢病毒（Lentivirus）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，有由于其感染潛伏期較長(zhǎng)，臨床癥狀發(fā)展緩慢，被稱(chēng)為慢病毒。而慢病毒載體則是在慢病毒的基礎(chǔ)上改變重組其構(gòu)成原件，進(jìn)而在去除其生物危害性的同時(shí)，利用其高感染等性能表達(dá)目的基因。人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）是常見(jiàn)的慢病毒載體改造原型。如下以HIV中最為常見(jiàn)的HIV-1型：
HIV-1為雙鏈RNA病毒，主要組分包含三種重要病毒核心基因：gag（編碼結(jié)構(gòu)蛋白或稱(chēng)為核心蛋白），pop（編碼復(fù)制相關(guān)酶類(lèi)），env（編碼包膜糖蛋白）；調(diào)節(jié)基因：tat（轉(zhuǎn)錄控制）和rev（表達(dá)調(diào)節(jié)）；四個(gè)輔助基因：vif、vpr、vpu、nef（作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染）；兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR (內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件)。
第一代慢病毒載體為雙質(zhì)粒系統(tǒng)，基本保留了HIV的所有組件，產(chǎn)毒滴度低，復(fù)制缺陷，且存在產(chǎn)生復(fù)制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng)，分為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓寬了病毒的感染宿主細(xì)胞范圍，雖然三質(zhì)粒降低了病毒重組的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附屬基因，產(chǎn)生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒載體則去除了HIV病毒所有輔助序列，只保留核心的3個(gè)基因（gag、pol、rev），病毒RNA不能轉(zhuǎn)錄，故意外重組的可能性很低；第四代慢病毒載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)，即將病毒核心基因分散在多個(gè)質(zhì)粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和載體質(zhì)粒)，同時(shí)去除tat，故病毒重組、產(chǎn)生活性病毒的可能進(jìn)一步降低，同時(shí)四質(zhì)粒系統(tǒng)中的載體質(zhì)粒中可以包含可誘導(dǎo)基因，使得該基因表達(dá)系統(tǒng)可以條件性調(diào)控。
慢病毒載體感染能力強(qiáng)、且宿主廣泛（分裂和非分裂細(xì)胞）；能夠整合進(jìn)宿主DNA且篩選后穩(wěn)定遺傳；表達(dá)潛伏期短，一般細(xì)胞24h-48h、體內(nèi)96小時(shí)可表達(dá)；慢病毒載體可以插入組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子；慢病毒攜帶基因的長(zhǎng)度大致無(wú)5kb以?xún)?nèi)。由于慢病毒依然是HIV來(lái)源，自然宿主是人，依然存在潛在的生物毒性，故操作時(shí)避免直接接觸人體。慢病毒載體適合常見(jiàn)類(lèi)型的體外研究（細(xì)胞），包括過(guò)表達(dá)、敲除、敲低都基因干預(yù)操作，但慢病毒載體不適合于體內(nèi)研究，因?yàn)槠涞味炔荒軌驖M(mǎn)足體內(nèi)用量且免疫原性較強(qiáng)。
(Expert Opin Biol Ther. 2013 Jul;13(7):987-1011. doi:10.1517/14712598.2013.779249.)
二、腺病毒載體
腺病毒（Adenovirus）是一種線性無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，腺病毒的衣殼結(jié)構(gòu)可以分為五鄰體和六鄰體兩部分，腺病毒的基因組主要包括病毒DNA復(fù)制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4（編碼病毒調(diào)節(jié)蛋白）和DNA復(fù)制后期的Ll～L5（編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白），以及兩端的反向重復(fù)序列，ITRs（包裝所必需的順式作用元件）。
在天然腺病毒（主要是人5型腺病毒）的基礎(chǔ)上改造而得的腺病毒載體，其基因攜帶量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒載體是刪除Ela、Elb基因的復(fù)制缺陷病毒，其復(fù)制必須在表達(dá)E1蛋白的細(xì)胞中，病毒滴度高且穩(wěn)定，不整合宿主基因組，但包裝量少（約為4.5kb），免疫原性強(qiáng)；第二代腺病毒載體進(jìn)一步刪減病毒原有基因，在減少免疫原性和細(xì)胞毒性的同時(shí)，進(jìn)一步提高載體容量，可以達(dá)到14kb，但是病毒滴度較低；第三代腺病毒載體則只保留了ITRs和包裝信號(hào)序列，因此其攜帶外源基因容量更大，約36 kb，但由于病毒包裝基因必須基因被刪除，第三代腺病毒載體工作組裝需要輔助病毒（表達(dá)腺病毒裝配必須基因），第三代腺病毒載體容量大，免疫原性低，但是量產(chǎn)困難，存在輔助病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。
腺病毒感染力強(qiáng)、宿主范圍廣（分裂和非分裂細(xì)胞），表達(dá)迅速（24h-48h）且表達(dá)量高，包裝容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因組內(nèi)，規(guī)避了整合入宿主基因組的生物風(fēng)險(xiǎn)，安全的同時(shí)也形成了細(xì)胞分裂過(guò)程中不能均等分配給子細(xì)胞。腺病毒載體適合一般體外實(shí)驗(yàn)，使用細(xì)胞類(lèi)型較多，免疫原性較強(qiáng)，不適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
（Med Microbiol Immunol. 2020 Jun;209(3):325-333. doi: 10.1007/s00430-019-00645-2）
（Eur J Cell Biol. 2012 Jan;91(1):2-9. doi: 10.1016/j.ejcb.2011.01.006）
三、腺相關(guān)病毒
腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是無(wú)包膜單鏈線狀DNA 缺陷型病毒，外包二十面體衣殼蛋白，基因組包括兩端的反向重復(fù)序列ITR（包含復(fù)制和包裝所需的唯一順式作用元件），中間的兩個(gè)核心基因：Rep 基因（編碼參與病毒復(fù)制、包裝和基因整合的蛋白），Cap（編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3）。AAV為復(fù)制缺陷病毒，不能獨(dú)立存在，其復(fù)制增殖需要輔助病毒作用。衣殼蛋白不同的AAV病毒，對(duì)組織器官的親和力不同，形成各種AAV血清型：如AAV1較易感染骨骼肌，AAV6較易感染肺部，AAV8則親嗜肝臟，AAV9則為神經(jīng)和外周組織（見(jiàn)后表）。
腺相關(guān)病毒載體（重組腺相關(guān)病毒載體, rAAV）的發(fā)展同樣在天然AAV的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化改進(jìn)。最早采用重組載體質(zhì)粒、目的基因質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、腺病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，步驟多、產(chǎn)率低、風(fēng)險(xiǎn)高；隨后采用目的基因載體、AAV基因載體(rep／cap)、輔助質(zhì)粒（包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似輔助功能的基因元件）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但包裝效率低，生物風(fēng)險(xiǎn)高；Ad/AAV嵌合載體、輔助質(zhì)粒感染恒定表達(dá)Rep/Cap細(xì)胞系的方法以及AAV生產(chǎn)細(xì)胞系法，這些方法均操作繁瑣；目前最常用的載體方法為Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)：將rAAV包裝組分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表達(dá)框的序列分別構(gòu)建到三個(gè)桿狀病毒中，分別轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9各自擴(kuò)增，然后通過(guò)共感染Sf9細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV，該方法可以量產(chǎn)、成本低、操作簡(jiǎn)單且不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生損傷。
AAV載體免疫原性極低，非常適合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，感染效率高，宿主范圍廣（分裂和不分裂細(xì)胞），不整合到基因組，穩(wěn)定表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（半年以上），但是表達(dá)水平低且慢（細(xì)胞需要1周，動(dòng)物需要2周），攜帶目的基因片段約為2kb。
(Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jan 8;8:166-180. doi: 10.1016/j.omtm.2018.01.002)
（Nat Rev Genet. 2020 Apr;21(4):255-272. doi: 10.1038/s41576-019-0205-4.）
總結(jié)
表1顯示的是不同血清型的AAV載體不同的特性比較，對(duì)于我們基礎(chǔ)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，重點(diǎn)關(guān)注其血清型對(duì)組織的親和力就可以，即表格中的tissue tropism（組織嗜性），在感染不同組織，即體內(nèi)研究中載體具體針對(duì)組織時(shí)，要選擇高親和力的AAV血清型。
（Nat Rev Genet. 2020 Apr;21(4):255-272. doi: 10.1038/s41576-019-0205-4.）
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