最大限度的保存細胞活力原代細胞的復(fù)蘇步驟你知道多少？

發(fā)布時間：

2021-12-15

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細胞庫源細胞、動物實驗、CRO服務(wù)、SCI潤色)

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細胞復(fù)蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢復(fù)到一般的生長狀態(tài)，今天我們來看看原代細胞的復(fù)蘇步驟

　　細胞一般儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。
　　細胞復(fù)蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢復(fù)到一般的生長狀態(tài)，今天我們來看看原代細胞的復(fù)蘇步驟。
　　一、檢查
　　收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。
　　二、冷凍細胞解凍
　　方法一：
　　1、準備好37度水浴鍋，預(yù)熱至37度；
　　2、準備好T25培養(yǎng)瓶，加入10ml完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)基量必須大于凍存液10倍體積）；
　　3、取出凍存細胞管，用一次性PE手套包裹凍存管（防止管內(nèi)進水導(dǎo)致污染），迅速放于水浴鍋內(nèi)，于1min內(nèi)融化完全；
　　4、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺內(nèi)；
　　5、吸取凍存管內(nèi)細胞懸液，加入步驟2中準備好的T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，8字緩慢搖勻；
　　6、培養(yǎng)瓶放于37度CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)24h，更換新鮮換培養(yǎng)基（注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法）。
　　方法二：
　　1、準備好37度水浴鍋，預(yù)熱至37度；
　　2、準備好15ml無菌離心管，加入10ml完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)基量必須大于凍存液10倍體積）；
　　3、準備好實驗用培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿；
　　4、取出凍存細胞管，用PE手套包裹凍存管（防止管內(nèi)進水導(dǎo)致污染），迅速放于水浴鍋內(nèi)，于1min內(nèi)融化完全；
　　5、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺內(nèi)；
　　6、吸取凍存管內(nèi)細胞懸液，加入步驟2中準備好的15ml無菌離心管，輕輕吹打混勻；
　　7、將離心管內(nèi)細胞懸液，按實驗需求接種于實驗器皿內(nèi)（注意接種密度不低于2×104/cm2），放于37度CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)24h，更換新鮮換培養(yǎng)基（注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法）。
　　三、細胞復(fù)蘇注意事項
　　1、整個復(fù)蘇過程要盡量快，溶解時間太長可能影響復(fù)蘇效果；
　　2、已溶解的凍存細胞盡量短時間的在常溫存放，盡快稀釋或者離心去除DMSO；
　　3、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里拿出來的凍存管，放到水里可能會造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會有水做緩沖；
　　4、取凍存管時要謹防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也最好穿長袖白大褂；
　　5、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來的凍存液，然后直接加完全培養(yǎng)基重懸細胞，接著把細胞轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿/瓶里培養(yǎng)。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大；
　　6、復(fù)蘇第二天記得去看看細胞，如果狀態(tài)還不錯的話就說明復(fù)蘇成功。