臨床前研究胰腺神經內分泌腫瘤的最新突破性的進展
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2022-05-13
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【摘要】胰腺神經內分泌腫瘤（pNEN）是相對罕見的胰島細胞起源的腫瘤，在組織病理學、生物學行為、臨床表現等方面異質性顯著。近年來，研究的推廣和認識的加深推動著國內外專家共識、臨床指南的快速更新。然而，pNEN發病率低、異質性高的特點使其臨床前研究工作在腫瘤學領域處于相對落后地位。多中心、跨區域乃至國際化合作既是保證研究罕見病樣本量的重要模式，也為對比分析不同遺傳背景pNEN的特征搭建平臺。隨著研究數據的快速積累，逐級細化研究亞型將有助于系統、全面地認識pNEN的群體異質性。此外，利用單細胞測序等前沿技術手段從細胞水平闡述 pNEN的個體異質性可能會帶來突破性的進展。
【關鍵詞】胰腺神經內分泌腫瘤;分子特征;疾病模型;臨床前研究
胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine neo-plasm，pNEN）是起源于胰島內分泌細胞的上皮性腫瘤，相對罕見占胰腺腫瘤的比例<5%。PNEN分布具有明顯地區差異∶在美國、英國等歐美地區，pNEN較小腸和直腸內分泌腫瘤少見;而在中國、印度等亞洲地區，pNEN是最常見的消化系統內分泌腫瘤"】。隨著臨床醫生對該疾病認識的加深以及影像學等診斷技術的進步，pNEN發病率在全球范圍內均明顯上升，這可能主要歸因于體積小、無癥狀腫瘤的檢出率增加。
高度異質性是 pNEN最鮮明的特征∶根據是否來源于家族性綜合征，分為散發性和遺傳相關性;根據腫瘤細胞分化，分為胰腺神經內分泌瘤（pancreatic neuroendocrine tu-mor，pNET）和神經內分泌癌（pancreatic neuroendocrine car-cinoma，pNEC），前者則依據增殖指數再分為G1、G2、G3級;根據是否出現激素過量分泌導致的相關臨床表現，分為無功能性和功能性。此外，pNEN在生物學行為、治療應答、預后等諸多方面均差異顯著。近年來，pNEN 領域關注度較高、研究成果頗豐，推動著國內外指南、共識的快速更新。
1. 高通量檢測技術在 pNEN 中的研究進展
以微陣列芯片、二代測序等技術為代表的高通量檢測不僅是研究pNEN分子特征的重要平臺，也為pNEN診斷與鑒別診斷、治療選擇與療效評估、隨訪監測等臨床實踐提供了具有廣闊前景的輔助手段。
1.1 基因組
1.1.1 基因變異
多發性內分泌腫瘤綜合征1型（muliple endocrine neoplasla type 1MENI）等家族性綜合征的發現是遺傳變異導致pNEN發生的重要例證。利用測序技術分析MENI等致病基因的胚系變異對以pNEN為首發癥狀的病人具有重要篩選價值。2011年，Jiao 等3l對散發性pNET 進行全外顯子測序（whole-exome seoenceingwES）分析聯合Samge測序驗證發現MEN/ 基因同樣具有高頻的體謂胞變異（44%）且里程碑式地揭示了43%的腫瘤存在染色質重塑復合物相關基因DLXXM7RX的互斥突變。此外，14%的pNET被檢測出mTOR通路相關基因突變從遺傳變異角度部分解釋了既往報道中該通路分子大量異常表達的原因。Scara等*對102 例散發性pNEN進行全基因組測序《whd一gamane yguensm。WGS）不僅驗證了上述研究結果還發現了D歷PDC5失活突變，EWSR!基因融合等新的miTOR 通路活化機制。日前對高頻突變的ATRX，QX，MEV八l-D-M）基因所遍礙的蛋自進行免疫潤化染色可用于銷助整別形態學區分國難的pNET和pNEC后者主要存在TP53和RB!基因突變。此外有研究顯示攜帶上述A-D-M突變的pNET病人術后復發轉移時間較野生型病人顯著縮短提示其作為預后指標的潛在生物學價值。mIOR拇制劑依維莫司是進展期ET的主要配向藥物RADIANT-3 Ⅱ期臨床試驗是示依維英司較安慰劑明顯廷長pNET病人的無進展生存期但對總生存期影響并不顯著表明獲得性耐藥可能削制了其臨床療效（~l。鑒于pNET中存在較高頓的mTOR通路抑制基因變異以突變為導向的配向道療可能有利于更精準地篩選病人使治療效益最大化9。
功能性腫瘤占 pNEN的10%-15%其中論大多數是胰島素瘤。C。等4檢測39例膜島素瘤發現與無功能性腫瘤不同前者僅存在MEN（25%），ATRX（25%））的低頻突變面DXX突變則未檢測到。進一步通過wE聯合Se和焦函酸測序驗證發型3a的胰島家瘤有在YV1基因（心CI113Gh官372R）的熱點突變。且功能學研究提示該突變具有致癌性。一項來白高加常人群的47例膜島素瘤測序結果顯示13強的樣本也存在談熱點突變?；谏鲜霭l現y/基因突變對于膜島素瘤的診斷具有一定提示意義。此外作為mTOR通路配基因。mTOR抑制劑對于攜帶該突變的病人可能具有治療價值。面其他功能性種瘤。如胃泌率瘤，胰高直攜案瘤等因病例罕見，鮮有報道是影響pFN預后的重要危購因素，21%~80的病人就診時即可發生遠處轉移一。Rov等時20例散發的無功能性 pNET轉移灶進行WE發現40%的種瘤組織被檢測出染色質重塑基因（sSETD2，ARID1A，CHD8，DVArT1）突變。且部分基因表達缺失與病人復發及生存時間呈顯著負相關。筆者團隊對轉移性pNET研究發現ARIDIA在275%的原發灶和30%的轉移灶中表達缺失，且這部分病人5年生存率明顯降低提示染色質重塑基因可能具有抑制pNET轉移的生物學功能。
1.1.2 基因劑量改變 除了飄動基因的突變外區域乃至染色體水平的大片斷DNA增減同樣在pNEN中具有重要意義。LaPmee等一發現散發作pNET中存在高相的非整倍體事件77%的腫瘤至少存在1條染色單體。進一步分析發現，10號染色體朝發雜合性缺失（bdhutwypay LOH）合并MEVI雙等位基國突變失活的亞退病人預后明是差商11號染色體LOH合并MEV失活的病人則預后較好揭示了LOH相關的新致癌機制。Yam等0l對65例來白RADIANT-3臨床試驗的pNET進行wE聯合配向測序分析發現染色體局灶的拷貝數變異（opy amder was∶mEim。CNV）事件少見>93%的樣本存在全染色體或染色體臂水平的L0H與拷貝數擴增。此外，A-D-M基因突變與染色體不穩定性升高顯著相關從基因功能角度推斷可能存在因果關系。Hoe等叫利用wGSwE分析211例pNET的CVV圖譜發現拷貝數擴增，缺失及正常的3種模式在無功能性pNET中均存在。且發生CNV的病人復發風險增高;膜島素瘤則不同無明顯拷貝數缺失事件發生面拷貝數正常的樣本 yy!基因突變率升高。關于轉移性pNETRny 等0增曾 報告73%的轉移灶被檢測出CDK.V2A基因的拷貝數缺失。Ba等調過單核苷酸多態性花片分析直徑≤3 的pNET發現48個樣本依據CNV可聚類為臨床特征不同的亞組，頻發拷貝數擴增，拷貝數正常的Lou及DAxX ATRX突變的病人肝轉移發生率高達73%表明拷貝數檢測對臨床風險評估具有提示意義。
1.2 轉錄組
轉錄組水平檢測是基因組改變的臉證與延伸。M。i∶與等通過微陣列芯片檢測力2例pNEN發現，mTOR通路抑制基因TSC2，PTEN在多數原發灶中表達下調支持既往P3K/AkmTOR通路在pEN中活化的研究結論。此外與無功能性pNEN相比SSTR2在胰島素瘤樣本中表達是著降低表明后者可能對生長抑素類似物道療反應不佳。Hagvik等l利用RNA測序（RNA 如qpemsim。RNAq）分析散發，無功能的pNEN 發現生物學行為調和（Ki-67<s%且無轉移）和不良（Ki-67》9且同時性轉移）的兩個亞組存在309個編礙基因的差異表達上述基因主要調控淚胞周期和分化提示其對pNEN 發展的促進作用，面mTB通路相關基器在不同生物學行為腔端中的表達則未見差異。
非編礙RNA通常在轉錄后水平發揮調控作用pNEN 中非編礙RNA研究主要見于mimRNA。一項旱期基于芯片檢測的報告是示miroRNA表達譜《mi-9%9%100 等）差異可用于pNEN與腺泡潤胞癌的整別;m次8-20g在胰島素瘤中特異性高表達∶參與PIEN調控的m次-2/表達與Ki-67指數，肝轉移顯著相關0I。Tharm等口檢測754個miroRNA發現mi-210表達與轉移事件相關;m次-193 在pNEN組織及血清中均表達升高提示其可作為潛在的診斷性標記物。Lee等評估mRNA-27等8個差異表達的micrN發度，m次N4-/9%與pEN我理學分攜，植價裂像，K=-67指數顯著相關且miRMA-19a高表達病人無病生存期及總生存期均顯著縮短表明其可能具備預測預后的價值。
1.3 表觀基因組
目前pNEN的表觀造傳研究主要集中于DNA甲基化修飾。一項基于80個靜瘤相關基因的甲基化花片死究是示無功能性pEN，胰島素耀和置泌素端各自具有特征性的DNA 甲基化圖譜提示上述腫種瘤分子發病機制不同以及甲基化特征用于pNEN分型的潛在價值口。近素Tu為等一利用甲基化老片對無功修性NE進行全基因組檢測發現MEN1綜合征相關性pNET較散發性和VHL 綜合征相關性病例存在更高的Cp心島甲基化發生率。此外Coaman等曾分析MENI相關的無功能性pNEN發現肝轉移病例的抑癌基因啟動子區存在更多的甲基化事件。最近L業三等問分析84例散發性pNET發現不同甲基化模式分退間存在特征性基因突變，染色體缺失等變異事件提示表觀遺傳異常是pNEN發生以及異質性產生的重要原因。既往研究顯示pNEN的高頓異常甲基化基因主要包括RASSF1，HC1，APC，CDKV2A，MGIT MLH1，LNE1 等且絕大數表現為甲基化水平升高問。值得注意的是行使移除鳥嘌呤上烷基功能的DNA損傷修復基因MGArT被認為具有化療指導價值。因啟動子區甲基化修飾面表達缺失的NEN 病例對替莫唑胺等烷化劑治療的有效反應率更高。
1.4 循環游離DNARNA
液體活檢技術在種瘤的診斷，監測等方面展現了良好的臨床應用價值。2018年Boumx 等首次在轉移性pNEN病人循環游離DNA中發現了種糊特異性基因變異。且變異等位基因頻牢與染色體不穩定性隨種瘤進展面增高表明基于游離DNA的液體活檢對評估腫瘤負荷和動態路測種瘤發展具有潛在價值以。Mod等1 發現循環游離RNA中存在神經內分泌種瘤特異性轉錄本。且基于51個特征性基因的mRNA開發了新的PCR直漿活檢被術（N可∶）。牙究證實。逐被術比護強標記物CA能更有效抱識別及預測 pNEN術后復發減。隨著然來越多pNEN特征性分子事件被揭示新的液體活檢策略將不斷產生有助于pNEN臨床診治效果的提升。
高通量檢測技術的普及與隨之面來的數據積累，整合為深入了解pNEN分子特征搭建了高效的研究平臺。然面受限于pFN的軍見性及異質性其關鍵價子圖譜遠被完全認識。此外絕大多數基于組學的研究結果缺少生物學章義的間述和職證。
2. pNE模型研究進展
疾病模型是用于分子功能，機制及藥物篩遺等臨床前研究的重要工具。由干對pNN認識起形較晚，生物學行為相對惰性、臨 床病例罕見等因素導致日前成熟的研究模型較其他常見種瘤明顯置乏。
2.1 人源淚胞系
pNEN人源淚胞系數目十分有限常見的包括BON-1，QCP-1和CM。BON-1來源于分泌5-羥色胺的pNEN轉移性淋巴結∶QG-1，CM分別來源于生長押瘤和預島素瘤司。上述淚胞在依維莫司，生長抑素類似物等pNEN一線藥物的初期療效評估中發揮了重要作用。然商這些潤胞系構建年代較為久遠隨著對pNEN認識的深入BON-1和QP-1國缺乏MEVI突變，SSTR低表達，增殖過快等因素代表性受到質疑。近來Beat等（利用胰島素瘤病人的淋巴結構建了增殖活性相對低《Ki-67 15%~20%）的pNET淚胞系 NT-3提供了更接近臨床實際的研究模型。隨后Lmy等可在轉錄和蛋自水平對比分析B0N-1（P-1和NT-3的多腫神經內分泌，上皮標記物表達認為前兩者具有分化好的神徑內分泌表型可用于pNET基礎研究。最近3D培養系統在pNEN研究中受到關注該系統能體現復雜的潤胞問交互作用以及通過基質潤胞共培養反映微環境對種瘤的影響較校常規2D培養更能復現pNEN的部分生物學特征0l。Apsil-Monm 等利用3D 系統或功將86%的pNEN 原代潤胞培養或具有內分泌表型的膜島樣類種瘤組織并進行了舒尼替尼，依維英司，替英唑胺等常見藥物的評估實驗使其成為個體化藥物篩遺的潛在平臺。日前成熟的pNEN淚胞系均來白于功能性腫瘤占pNEN比重>60%的無功能性腫瘤尚缺乏代表性潤胞系亟待解決。
2.2 人源異種移植PDX模型
淚胞系是種瘤研究中最常觀，簡便的模型但由于缺少完整微環境以及多次傳代后可能出現的遺傳變異。導致其難以模擬種糊的實際情況。人源異種移植（patiat-山riowdxaogafPDX）直接來源于新鮮潤織很大配度上保閥了高代護端的特征是臨床用藥篩選的可靠工具。Chembrhin等叫對pNEN的 PDX研究發現幾經傳代該模型仍然維持pNEN的形態學特征及特異性基因突變和表達。進一些藥物實臉是示，部分HDX 出現了臨床常見的依維莫司耐藥現象并發現新型mTOR 想制劑s取un有b對依維整司耐藥護倒仍然產生治療反應，體現了PDX良好的臨床前蛋究價值。然面pEN的PDX模型構建工作卻充滿挑戰。一項早期包含106例神授內分泌種瘤（eNEN8例）的PDX牙究發現，僅7例（eEN3 例）或功種植于小鼠且僅1例發生肝轉移的擔囊神徑內分泌種瘤可持續傳代C。同樣Krmra等報道39例pNET 中僅1例成功構建出PDX模型。進一步分析發現肝謂胞生長因子酪氨酸激酶變體MET的激活是pNET淚胞能在免疫缺陷小鼠上生長的關鍵。pNEN則相對容易構建PDX 日前至少存在19種消化道pNEN的 PDX模型?？赡苡捎趐NE較為罕見且組織獲取難度高相關報道少見。如何提高pNET建模咸功率以最大限度地發揮 PDX的臨床轉化效用值得深入研究。
2.3 基因工程小鼠動物模型
基因工程小鼠原位模型是日前種類最多的pNN研究樹型。早在20世配80年代，文獻【39-40】分別利用胰島素和前胰高直糖案原基因啟動子在個屬胰島β和a淚胞中表達SV40病毒大T抗原構建了胰島素瘤（RIP-Tmg）和胰高血糖素瘤（Gh2-Te）的轉基因模型。隨著對pNEN分子特征認識的深入CaLbnr等首次報道通過全身雜合性敲除 Mm/基因構建了MENI綜合征模型（Mm/）該模型小鼠在9~16個月齡可形成胰島素瘤。此后該團隊又借助ce-LP技術利用胰島素基因啟動子在β潤胞條件性敲除 Mm/基因3-8號外是子構建了胰島素瘤模型（Nm1-w）【4。有像的是基利用前胰高血糖素原啟動子在a潤胞敲除Mm1早期可形威胰高血糖素瘤，胰島素瘤以及兩者的混合瘤>12個月齡則幾平均為胰島素瘤推測a謂胞中Mm/缺失可產生分化轉移這也許部分解釋了功能性pNEN中瓶島素熵占大多數的原因。近年來，K心avchi等利用既往C57B6I背景的BIP-Taug 小屬與A背景個屬雜交后獲得了無功能性pNEN模型AB6目6%的個屬發生桿物移，與嘴床實際吻合度較高。除上述幾種主要個屬模型外其他報道通過特異性基國啟動子張合或單貌較人密基碼（如cVhrAu/）皮敲入抑盛基因（如Pro）等構建了各具特征的pNN校型?；蚬€鼠主要優勢在于具備完善的免疫系統以及能連續觀察病情進展但也存在建模時間長，花費大，或功率不穩定等缺陷。
2.4 類器官模型
類器官模型是干淚胞或器官特異性祖潤胞在體外分化，增殖為與親代器官在結構和功能上相似的復雜3D組織具有自我更新和自我組織的特性（l。近些年該模型因在再生醫學、基因治療、個體化藥物治療等領域應用前景廣泛商成為研究熱點。目前類器官在pNEN 中的研究鮮有報道。最近Kawa或等一利用新鮮臨床樣本構建了包含25個神經內分泌種瘤（1例pNET，2例pNE）的類器官庫。進一步通過個鼠異體移植培養及多組學分析發現類器官模型與臨床樣本在組織病理學，功能學特征和遺傳變異方削存在較高的相似性表明I有顳究個體靜增生物學行為和評估特異性邊療策感的重要意義。然面對于分化好的種窟16例樣本僅建功構建了3個類器宜構型，可見真正發擺嘴床實用價值還組經歷很長的探索之路。
上述pNEN模型各具優勢和不足應依據實際需要和科研條件選擇最合適的幫究模型。道臨床寶際面言，缺少酸發性，無功能的pET模型一定裂度上制約了pE基礎研究以及臨床診行的進展。
3. 結語
近年來以二代測序為代表的高通量檢測技術發展迅猛從基因組，轉錄組，表觀基因組等多個水平揭示了pNEN的分子特征部分研究結果已經運用于臨床診療工作轉化意義顯著。開發具有代表性的pNEN模型是推動整體研究進程的關鍵pNEN的淚胞系，PDX基因小鼠等傳流研究模型種類在近些年得到擴充面以類器官為代表的新型pNEN模型也顯示了其狼特的優勢值得深入探索。然商pNEN 發病率低，異質性高的特點使其臨床前研究工作在種增學館域仍處干相對落后抱位。多中心藥區境乃至國際化合作既是保證研究罕見病樣本量的重要模式也為對比分析不同遺傳背景eEN的特征搭建平臺。隨著牙究數據的快違職署邏級退化幫究亞型濟有助干彩統全面抱認識時NEN的群體異質性。此外，利用單退胞測序等前沿技術手段從潤胞水平嗣述pNEN的個體異質性可能會帶表實繁性的進展。
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