保存細(xì)胞的復(fù)蘇凍存方法，凍存和復(fù)蘇的原則這些要點(diǎn)你清楚嗎？

發(fā)布時(shí)間：

2021-12-21

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤色)

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細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化

　　細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化，特別是當(dāng)你采購的ATCC細(xì)胞如：人源細(xì)胞，鼠源細(xì)胞時(shí)，如果保存不妥當(dāng)，將會(huì)對(duì)你的項(xiàng)目及成本造成極大的影響。
　　一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
　　當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
　　如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
　　二、慢凍程序
　　1、標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
　　當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)， 1~2 ℃/min；
　　當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min；
　　當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。
　　2、簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
　　3、傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽長期儲(chǔ)存。
　　三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用
　　在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。
　　常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
　　四、細(xì)胞凍存方法
　　1、預(yù)先配制凍存液
　　10%DMSO + 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
　　10%甘油+ 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
　　2、取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml）
　　3、加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存
　　五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
　　1、快速解凍
　　凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。
　　2、解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
　　3、如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感
　　解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。