大鼠/小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具體步驟及注意事項(xiàng)分享

發(fā)布時(shí)間：

2022-01-14

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小鼠/大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，一般選用生后1-10d的乳鼠心臟，尤以出生1-4d的較好，此時(shí)心肌細(xì)胞已分化充分，適于作各種研究，而出生4d以后的乳鼠心臟中分離出來的心肌細(xì)胞較慢發(fā)育成為有自律性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞

　　一、概述
　　整體動(dòng)物心肌細(xì)胞的增殖能力在出生后僅能維持一個(gè)短時(shí)期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌細(xì)胞的增殖能力就明顯降低至成年鼠水平。小鼠/大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，一般選用生后1-10d的乳鼠心臟，尤以出生1-4d的較好，此時(shí)心肌細(xì)胞已分化充分，適于作各種研究，而出生4d以后的乳鼠心臟中分離出來的心肌細(xì)胞較慢發(fā)育成為有自律性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。
　　二、試劑
　　1、培養(yǎng)液：1：1 混合的DMEM / F12 培養(yǎng)液，添加終濃度為10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 鏈霉素。
　　2、消化液：胰酶（效價(jià)為1：250） 0.08%、膠原酶II（活力為150U/mg） 0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
　　3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4?7H2O 0.09 g 、酚紅 0.01 g 1L。
　　三、實(shí)驗(yàn)步驟
　　取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮膚，再用大頭針固定乳鼠的頭及四肢，剪開胸部皮膚，用75%乙醇消毒皮下組織，更換鑷子及剪刀，開胸取出心臟，將心臟放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪開心室，用D-Hanks溶液沖洗三次，去除殘留積血后，將心臟剪成1mm3 大小的碎片，再將心臟碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，自然沉淀，棄上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振搖幾下），用吸管吹打1min 后，將未消化完全的心臟碎片吸出至另一離心管中，加入2ml冷的培養(yǎng)液終止消化，1000 rpm 5min ，棄上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，棄上清，沉淀中加入培養(yǎng)液2ml，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液。上述未消化完全的心臟碎片補(bǔ)加5ml左右消化液后繼續(xù)消化，同樣操作，合并細(xì)胞懸液后放入培養(yǎng)瓶中m二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃ 5%CO2）培養(yǎng)。
　　四、培養(yǎng)結(jié)果
　　在二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃ 5%CO2）培養(yǎng)24 h后可見搏動(dòng)的單層心肌細(xì)胞。