大鼠/小鼠心肌細胞原代培養(yǎng)實驗具體步驟及注意事項分享

發(fā)布時間：

2022-01-14

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小鼠/大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)，一般選用生后1-10d的乳鼠心臟，尤以出生1-4d的較好，此時心肌細胞已分化充分，適于作各種研究，而出生4d以后的乳鼠心臟中分離出來的心肌細胞較慢發(fā)育成為有自律性搏動的心肌細胞

　　一、概述
　　整體動物心肌細胞的增殖能力在出生后僅能維持一個短時期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌細胞的增殖能力就明顯降低至成年鼠水平。小鼠/大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)，一般選用生后1-10d的乳鼠心臟，尤以出生1-4d的較好，此時心肌細胞已分化充分，適于作各種研究，而出生4d以后的乳鼠心臟中分離出來的心肌細胞較慢發(fā)育成為有自律性搏動的心肌細胞。
　　二、試劑
　　1、培養(yǎng)液：1：1 混合的DMEM / F12 培養(yǎng)液，添加終濃度為10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 鏈霉素。
　　2、消化液：胰酶（效價為1：250） 0.08%、膠原酶II（活力為150U/mg） 0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
　　3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4?7H2O 0.09 g 、酚紅 0.01 g 1L。
　　三、實驗步驟
　　取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮膚，再用大頭針固定乳鼠的頭及四肢，剪開胸部皮膚，用75%乙醇消毒皮下組織，更換鑷子及剪刀，開胸取出心臟，將心臟放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪開心室，用D-Hanks溶液沖洗三次，去除殘留積血后，將心臟剪成1mm3 大小的碎片，再將心臟碎片轉移至離心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，自然沉淀，棄上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振搖幾下），用吸管吹打1min 后，將未消化完全的心臟碎片吸出至另一離心管中，加入2ml冷的培養(yǎng)液終止消化，1000 rpm 5min ，棄上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，棄上清，沉淀中加入培養(yǎng)液2ml，用吸管吹打制成細胞懸液。上述未消化完全的心臟碎片補加5ml左右消化液后繼續(xù)消化，同樣操作，合并細胞懸液后放入培養(yǎng)瓶中m二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃ 5%CO2）培養(yǎng)。
　　四、培養(yǎng)結果
　　在二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃ 5%CO2）培養(yǎng)24 h后可見搏動的單層心肌細胞。