C8-D1A小鼠腦星形細(xì)胞要怎么培養(yǎng)？實(shí)驗(yàn)具體操作步驟是什么？要注意什么？

發(fā)布時(shí)間：

2022-01-21

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將小鼠處死后浸泡入體積分?jǐn)?shù)75% 乙醇中消毒，以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦（剔除海馬部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表層血絲，至腦組織呈乳白色

　　正常C8-D1A小鼠腦星形細(xì)胞培養(yǎng)
　　一、實(shí)驗(yàn)試劑
　　1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
　　2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
　　3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
　　4、染色液： 0.4% Trypan Blue
　　5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
　　6、檢測(cè)試劑：抗小鼠CD 11b/c抗體，熒光標(biāo)記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
　　二、實(shí)驗(yàn)器械
　　1、培養(yǎng)皿
　　2、培養(yǎng)瓶
　　3、直剪和眼科剪
　　4、眼科鑷和止血鉗
　　5、10ml注射器
　　6、玻璃滴管
　　7、燒杯
　　8、15ml離心管
　　三、實(shí)驗(yàn)流程
　　取材
　　↓
　　去除大腦腦膜及血管,剔除海馬部分
　　↓
　　1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表層血絲
　　↓
　　先用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，用眼科剪反復(fù)剪10min，再用移液器輕輕吹打20~30次。
　　↓
　　將組織轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，加入消化液（PriCells）
　　↓
　　將離心管放置到37℃，15-20min水浴恒溫消化
　　↓
　　加入消化終止液（PriCells）終止反應(yīng)
　　↓
　　離心，1000rmp,10min，棄去上清
　　↓
　　重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞
　　↓
　　接種密度以1 × 106 個(gè)/ml
　　↓
　　培養(yǎng)37℃，5%CO2
　　四、實(shí)驗(yàn) 操作
　　1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無(wú)菌），4℃冰箱放置，備用。
　　2、取材：正常昆明小鼠（生后24h內(nèi)）。
　　3、材料預(yù)處理：將小鼠處死后浸泡入體積分?jǐn)?shù)75% 乙醇中消毒，以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦（剔除海馬部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表層血絲，至腦組織呈乳白色。
　　4、消化液：用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，再用眼科剪反復(fù)剪10min，最后再用移液槍輕輕吹打20~30次，將剪碎的組織用槍轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，37℃水浴消化15min。
　　5、終止消化：按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)。
　　6、收集重懸細(xì)胞：1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。
　　7、培養(yǎng)細(xì)胞密度：調(diào)整細(xì)胞密度以1 × 106 個(gè)/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
　　8、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中。
　　五、細(xì)胞鑒定
　　1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞呈星形狀，細(xì)胞密度增高后呈現(xiàn)鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點(diǎn)。細(xì)胞具備良好的透光性。
　　2、免疫組織化學(xué)鑒定：利用OX-42 （CD 11b/c）免疫熒光染色。
　　3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞為3×104 個(gè)/孔，48小時(shí)候細(xì)胞可以長(zhǎng)滿，用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
　　4、細(xì)胞固定：用PBS洗滌細(xì)胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
　　5、特異性抗體：按照說(shuō)明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
　　6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
　　7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體，37℃孵育30min。
　　洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
　　8、封片：封片劑封片。
　　9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，膠質(zhì)細(xì)胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)黃綠色熒光，細(xì)胞核周圍尤其明顯。
　　六、注意事項(xiàng)
　　1、選材注意選取新生昆明小鼠（24h內(nèi)）。取材過(guò)程盡可能保證無(wú)菌，盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。
　　2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細(xì)胞及某些血清成分對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞貼壁的影響。
　　3、膠質(zhì)細(xì)胞分離損傷嚴(yán)重影響膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時(shí)間。
　　4、嚴(yán)格控制膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
　　5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒(méi)有特別大的差異。實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被。
　　6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為1×106 個(gè)（25 cm2 培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時(shí)間為36小時(shí)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代，傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞之間間隙增加，細(xì)胞貼壁牢固，傳代消化時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng)。