C8-D1A小鼠腦星形細胞要怎么培養？實驗具體操作步驟是什么？要注意什么？
發布時間：
2022-01-21
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正常C8-D1A小鼠腦星形細胞培養
一、實驗試劑
1、培養基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：抗小鼠CD 11b/c抗體，熒光標記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
二、實驗器械
1、培養皿
2、培養瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、10ml注射器
6、玻璃滴管
7、燒杯
8、15ml離心管
三、實驗流程
取材
↓
去除大腦腦膜及血管,剔除海馬部分
↓
1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表層血絲
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先用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，用眼科剪反復剪10min，再用移液器輕輕吹打20~30次。
↓
將組織轉移至15ml離心管中，加入消化液（PriCells）
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將離心管放置到37℃，15-20min水浴恒溫消化
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加入消化終止液（PriCells）終止反應
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離心，1000rmp,10min，棄去上清
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重懸，計數細胞
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接種密度以1 × 106 個/ml
↓
培養37℃，5%CO2
四、實驗 操作
1、培養瓶預包被。試驗前一天預包培養瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常昆明小鼠（生后24h內）。
3、材料預處理：將小鼠處死后浸泡入體積分數75% 乙醇中消毒，以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦（剔除海馬部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表層血絲，至腦組織呈乳白色。
4、消化液：用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，再用眼科剪反復剪10min，最后再用移液槍輕輕吹打20~30次，將剪碎的組織用槍轉移至15ml離心管中，37℃水浴消化15min。
5、終止消化：按1：1加入消化終止液，中止酶反應。
6、收集重懸細胞：1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養液重懸，染色計數細胞。
7、培養細胞密度：調整細胞密度以1 × 106 個/ml 接種入培養瓶。
8、培養：放置于37℃，5% CO2 培養箱中。
五、細胞鑒定
1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細胞呈星形狀，細胞密度增高后呈現鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點。細胞具備良好的透光性。
2、免疫組織化學鑒定 ：利用OX-42 （CD 11b/c）免疫熒光染色。
3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養板中，接種細胞為3×104 個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。
4、細胞固定：用PBS洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
7、標記性抗體：加入熒光標記抗體，37℃孵育30min。
洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
8、封片：封片劑封片。
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，膠質細胞包質呈現較強黃綠色熒光，細胞核周圍尤其明顯。
六、注意事項
1、選材注意選取新生昆明小鼠（24h內）。取材過程盡可能保證無菌，盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。
2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細胞及某些血清成分對膠質細胞貼壁的影響。
3、膠質細胞分離損傷嚴重影響膠質細胞的生長，因此應嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
4、嚴格控制膠質細胞培養條件。包括細胞培養用液（培養基，生長因子，血清，抗生素）的質量，濃度。
5、關于培養瓶包被與否，有文獻研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中，可以酌情考慮是否包被。
6、傳代培養細胞接種量為1×106 個（25 cm2 培養瓶），細胞倍增時間為36小時。細胞傳代培養最佳為5-8代， 傳代次數增加，細胞體積增大，細胞之間間隙增加，細胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。
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