新型hbv相關(guān)肝細(xì)胞癌小鼠模型的構(gòu)建及其免疫致病機(jī)理探究

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-13

來源：

專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤色)

作者：

吉妮歐

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主要通過利用肝細(xì)胞替代技術(shù)建立了一種構(gòu)建HBV小鼠模型的方法，用于HBV的免疫損傷研究

　　慢性HBV感染是全球一大公共健康問題，全球約2.6億的人口面臨著因慢性HBV感染導(dǎo)致的肝炎，肝纖維化，肝硬化以及肝癌的威脅。雖然目前己經(jīng)開發(fā)出了預(yù)防性疫苗，可以有效的降低HBV新發(fā)感染的幾率，但是在低收入
國家預(yù)防性疫苗的普及率仍然很低。另外，針對慢性HBV病人尚未建立有效的治療手段，通用的核昔類似物聯(lián)合干擾素的治療方法雖然可以有效地抑制病毒的復(fù)制，但是并不能徹底清除病毒，并且在停藥后有明顯的反彈現(xiàn)象，慢性HBV感染患者仍面臨著發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，闡明慢性HBV感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機(jī)制就尤為重要。HBV病毒可以通過宿主細(xì)胞基因整合而導(dǎo)致肝細(xì)胞中原癌基因的活化或者抑癌基因的失活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，同時(shí)機(jī)體免疫系統(tǒng)對被HBV感染的肝細(xì)胞的持續(xù)攻擊會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的反復(fù)損傷和再生，免疫攻擊也是致使肝細(xì)胞癌惡性轉(zhuǎn)化的必要因素之一HBV抗原特異性的CD8+T對被感染的肝細(xì)胞的攻擊是導(dǎo)致免疫損傷的最主要的因素，但是因?yàn)闆]有合適的動(dòng)物型目前還沒有對這一免疫損傷過程進(jìn)行深入細(xì)致的研究。本研究主要通過利用肝細(xì)胞替代技術(shù)建立了一種構(gòu)建HBV小鼠模型的方法，用于HBV的免疫損傷研究，并獲得了以下幾項(xiàng)結(jié)果:
　　1.利用肝細(xì)胞替代技術(shù)成功構(gòu)建HBV相關(guān)肝癌小鼠模型。
　　首先通過肝臟灌流的方法分離了HBs轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠和野生型(C57BL6/J)小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞;然后使用脾內(nèi)轉(zhuǎn)輸?shù)姆椒ò?.0X106肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給8-12周齡免疫系統(tǒng)健全的Fah缺陷小鼠，進(jìn)行肝細(xì)胞重建;撤去Fah缺陷小鼠的NTBC水供應(yīng)，讓受體小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡，為供體小鼠肝細(xì)胞的生長提供空間。經(jīng)過12周的肝細(xì)胞重建，我們可以成功構(gòu)建HBs-Tg肝細(xì)胞取代小鼠(HBs-HepR)和其對照B6-HepRoHBs-HepR小鼠血清和組織中均可以檢測到HBsAg表達(dá)。
　　2.肝臟取代重建的HBs-HepR小鼠表現(xiàn)出慢性肝炎，肝纖維化和肝癌。
　　相較于對照B6-HepR小鼠，當(dāng)延長肝細(xì)胞的重建時(shí)間至18周后，HBs-HepR小鼠表現(xiàn)為ALT水平的升高，并在重建6個(gè)月后肝臟出現(xiàn)了纖維化。當(dāng)重建到9個(gè)月后，所有的HBs-HepR小鼠肝臟中均出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，經(jīng)基因水平和組織水平的鑒定證實(shí)其為HCC，該HBV相關(guān)的HCC模型與己有的其他小鼠HCC模型不同，且與人HBV感染導(dǎo)致的HCC具有相同的分子表型。
　　3.抗原特異性CD8+T細(xì)胞在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　通過單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在HBs-HepR小鼠肝臟中的CD8+T細(xì)胞發(fā)生了明顯的活化，并且在免疫攻擊的時(shí)間點(diǎn)有更多CD8+T細(xì)胞由naive表型向效應(yīng)性表型轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步我們通過流式細(xì)胞分析和免疫熒光檢測驗(yàn)證了在HBs-HepR小鼠肝臟中存在HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞，并且介導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步通過抗體的清除和基因缺陷的方法，我們證明CD8+T細(xì)胞的缺失可以顯著降低HCC的發(fā)生率。HBsAg致敏過的脾臟CD8+T細(xì)胞的回輸可逆轉(zhuǎn)HBs-HepR-CD8K0小鼠肝臟HCC的發(fā)生發(fā)展。
　　4.在HBs-HepR小鼠介導(dǎo)的損傷中B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞不起關(guān)鍵作用。
　　在HBs-HepR小鼠中不能產(chǎn)生針對HBsAg的抗體，甚至使用鋁佐劑的HBsAg疫苗外周免疫攻擊也不能產(chǎn)生Anti-HBs抗體，說明HBs-HepR小鼠的肝細(xì)胞損傷可能不是由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體導(dǎo)致的。
　　而使用抗體清除CD4+T細(xì)胞或者NK細(xì)胞后，HBs-HepR小鼠仍然全部會(huì)發(fā)生HCC，與未清除組小鼠相比沒有明顯的變化，說明CD4+T細(xì)胞與NK細(xì)胞在HCC的發(fā)生發(fā)展中不起重要作用。
　　5.在HBs-HepR成瘤小鼠肝臟中的T/NK細(xì)胞處于功能耗竭的狀態(tài)。
　　使用單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在形成腫瘤的HBs-HepR小鼠肝臟中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能性分子IFN-y等表達(dá)下降，同時(shí)利用流式細(xì)胞分析驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。說明在發(fā)生腫瘤后，腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致了肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞的功能耗竭促進(jìn)了腫瘤的逃逸。
　　6.利用HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠來源的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞亦可建立HBV小鼠模型。
　　當(dāng)使用1.0x10“個(gè)C57BL/6J背景的HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠來源的肝細(xì)胞進(jìn)行模型構(gòu)建時(shí)，我們也可以成功構(gòu)建肝細(xì)胞替代的HBV小鼠模型(HBV-HepR)，在受體小鼠Fah缺陷的小鼠體內(nèi)可以檢測到HBcAg陽性的肝細(xì)胞，并且在血清中可以檢測到HBeAg}HBsAg以及HBV-DNA的表達(dá)。但是重建12個(gè)月后，的HBV-HepR小鼠模型并不會(huì)自發(fā)HCC.
　　關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒，原發(fā)性肝細(xì)胞癌，抗原特異性CD8+T，慢性炎癥，肝癌小鼠模型