新型hbv相關肝細胞癌小鼠模型的構(gòu)建及其免疫致病機理探究
發(fā)布時間：
2022-04-13
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慢性HBV感染是全球一大公共健康問題，全球約2.6億的人口面臨著因慢性HBV感染導致的肝炎，肝纖維化，肝硬化以及肝癌的威脅。雖然目前己經(jīng)開發(fā)出了預防性疫苗，可以有效的降低HBV新發(fā)感染的幾率，但是在低收入
國家預防性疫苗的普及率仍然很低。另外，針對慢性HBV病人尚未建立有效的治療手段，通用的核昔類似物聯(lián)合干擾素的治療方法雖然可以有效地抑制病毒的復制，但是并不能徹底清除病毒，并且在停藥后有明顯的反彈現(xiàn)象，慢性HBV感染患者仍面臨著發(fā)生肝癌的風險。因此，闡明慢性HBV感染導致肝癌發(fā)生的機制就尤為重要。HBV病毒可以通過宿主細胞基因整合而導致肝細胞中原癌基因的活化或者抑癌基因的失活進而導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化，同時機體免疫系統(tǒng)對被HBV感染的肝細胞的持續(xù)攻擊會導致肝細胞的反復損傷和再生，免疫攻擊也是致使肝細胞癌惡性轉(zhuǎn)化的必要因素之一HBV抗原特異性的CD8+T對被感染的肝細胞的攻擊是導致免疫損傷的最主要的因素，但是因為沒有合適的動物型目前還沒有對這一免疫損傷過程進行深入細致的研究。本研究主要通過利用肝細胞替代技術建立了一種構(gòu)建HBV小鼠模型的方法，用于HBV的免疫損傷研究，并獲得了以下幾項結(jié)果:
1.利用肝細胞替代技術成功構(gòu)建HBV相關肝癌小鼠模型。
首先通過肝臟灌流的方法分離了HBs轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠和野生型(C57BL6/J)小鼠的肝實質(zhì)細胞;然后使用脾內(nèi)轉(zhuǎn)輸?shù)姆椒ò?.0X106肝實質(zhì)細胞轉(zhuǎn)輸給8-12周齡免疫系統(tǒng)健全的Fah缺陷小鼠，進行肝細胞重建;撤去Fah缺陷小鼠的NTBC水供應，讓受體小鼠肝實質(zhì)細胞死亡，為供體小鼠肝細胞的生長提供空間。經(jīng)過12周的肝細胞重建，我們可以成功構(gòu)建HBs-Tg肝細胞取代小鼠(HBs-HepR)和其對照B6-HepRoHBs-HepR小鼠血清和組織中均可以檢測到HBsAg表達。
2.肝臟取代重建的HBs-HepR小鼠表現(xiàn)出慢性肝炎，肝纖維化和肝癌。
相較于對照B6-HepR小鼠，當延長肝細胞的重建時間至18周后，HBs-HepR小鼠表現(xiàn)為ALT水平的升高，并在重建6個月后肝臟出現(xiàn)了纖維化。當重建到9個月后，所有的HBs-HepR小鼠肝臟中均出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，經(jīng)基因水平和組織水平的鑒定證實其為HCC，該HBV相關的HCC模型與己有的其他小鼠HCC模型不同，且與人HBV感染導致的HCC具有相同的分子表型。
3.抗原特異性CD8+T細胞在HBV相關肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。
通過單細胞測序技術發(fā)現(xiàn)，在HBs-HepR小鼠肝臟中的CD8+T細胞發(fā)生了明顯的活化，并且在免疫攻擊的時間點有更多CD8+T細胞由naive表型向效應性表型轉(zhuǎn)化。進一步我們通過流式細胞分析和免疫熒光檢測驗證了在HBs-HepR小鼠肝臟中存在HBsAg特異性CD8+T細胞，并且介導了肝細胞的凋亡。進一步通過抗體的清除和基因缺陷的方法，我們證明CD8+T細胞的缺失可以顯著降低HCC的發(fā)生率。HBsAg致敏過的脾臟CD8+T細胞的回輸可逆轉(zhuǎn)HBs-HepR-CD8K0小鼠肝臟HCC的發(fā)生發(fā)展。
4.在HBs-HepR小鼠介導的損傷中B細胞，CD4+T細胞和NK細胞不起關鍵作用。
在HBs-HepR小鼠中不能產(chǎn)生針對HBsAg的抗體，甚至使用鋁佐劑的HBsAg疫苗外周免疫攻擊也不能產(chǎn)生Anti-HBs抗體，說明HBs-HepR小鼠的肝細胞損傷可能不是由B細胞產(chǎn)生的抗體導致的。
而使用抗體清除CD4+T細胞或者NK細胞后，HBs-HepR小鼠仍然全部會發(fā)生HCC，與未清除組小鼠相比沒有明顯的變化，說明CD4+T細胞與NK細胞在HCC的發(fā)生發(fā)展中不起重要作用。
5.在HBs-HepR成瘤小鼠肝臟中的T/NK細胞處于功能耗竭的狀態(tài)。
使用單細胞測序技術發(fā)現(xiàn)在形成腫瘤的HBs-HepR小鼠肝臟中T細胞和NK細胞的功能性分子IFN-y等表達下降，同時利用流式細胞分析驗證了這一現(xiàn)象。說明在發(fā)生腫瘤后，腫瘤微環(huán)境導致了肝臟內(nèi)免疫細胞的功能耗竭促進了腫瘤的逃逸。
6.利用HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠來源的肝實質(zhì)細胞亦可建立HBV小鼠模型。
當使用1.0x10“個C57BL/6J背景的HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠來源的肝細胞進行模型構(gòu)建時，我們也可以成功構(gòu)建肝細胞替代的HBV小鼠模型(HBV-HepR)，在受體小鼠Fah缺陷的小鼠體內(nèi)可以檢測到HBcAg陽性的肝細胞，并且在血清中可以檢測到HBeAg}HBsAg以及HBV-DNA的表達。但是重建12個月后，的HBV-HepR小鼠模型并不會自發(fā)HCC.
關鍵詞:乙型肝炎病毒，原發(fā)性肝細胞癌，抗原特異性CD8+T，慢性炎癥，肝癌小鼠模型
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