研究藥物骨毒性臨床前評價方法和藥物骨毒性臨床前評價方法的進展
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2022-05-12
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【摘要】
骨骼是人體重要的系統，具有支持、保護、造血、維持礦物質平衡等功能，目前藥物骨毒性問題已引起全球關注，其臨床前評價非常重要。藥物骨毒性臨床前評價方法主要包括檢測骨密度、骨組織形態學、骨強度和骨代謝指標等。Wnt/β-catenin、RANKL/RANKOPG和BMP-2/Smads等信號通路參與調控骨代謝過程，因此深入了解這些信號通路可為藥物骨毒性臨床前評價提供新的思路。
【關鍵詞】
骨骼;藥物評價，臨床前;骨質疏松
骨由中胚層間充質干細胞增殖分化而來，具有支持軀體、保護體內重要器官、供肌肉附著、作運動杠桿、造血等作用。研究發現已上市藥物中存在大量骨毒性風險藥物，主要引起骨量減少、骨質疏松、骨代謝紊亂以及骨微結構受損等。糖皮質激素廣泛用于治療免疫性疾病、急性炎癥、血液系統疾病等，但長期服用糖皮質激素，可導致患者骨質脆弱和骨骼再生能力受損。喹諾酮類藥物是一類廣譜抗菌藥物，但動物實驗證實喹諾酮類藥物對各類幼齡動物的關節軟骨均有毒性，這使得其在兒科的應用受到限制。
另外，有研究顯示50% 以上服用抗癲癇藥物的癲癇患者會發生骨骼形態異常、骨質疏松、骨代謝紊亂等不良反應。因此，需加強藥物骨毒性臨床前的評價工作，從而提高臨床用藥安全，目前已有許多國內外非臨床安全性評價指導原則指出，當藥物對人的骨結構或骨代謝產生不良反應時，需開展針對于骨毒性評價的臨床前試驗以解決上述擔憂，但這些指導原則中并未詳細描述骨毒性評價的指標及方法。此外，藥物骨毒性的分子機制尚不明確，這也阻礙了藥物骨毒性評價的進一步發展。因此，本文通過綜述藥物骨毒性臨床前評價方法及其毒性機制的研究進展，以期為藥物骨毒性評價提供參考。
藥物骨毒性臨床前評價方法
1骨密度（BMD）
檢測 BMD是指單位體積或面積的骨礦含量，BMD降低是藥物出現骨毒性的陽性指標，如噻唑烷二酮類藥物、糖皮質激素、選擇性 5-羥色胺再攝取抑制劑、非甾體抗炎藥等，同時 BMD 的降低也意味著骨量的減少，骨折風險的增加。目前 BMD 的檢測方法眾多，包括雙能X射線骨密度吸收法（DXA）、定量計算機斷層照相術、外周定量計算機斷層照相術、定量超聲 BMD測量術、微計算機斷層掃描法（Micro-CT）等。其中 DXA被公認為診斷骨質疏松癥的"金標準"。但 DXA 檢測所得BMD為面積骨礦含量，只能得到二維骨微結構信息，易受到骨骼尺寸和周圍軟組織密度改變的影響。Micro-CT采用微焦點X射線球管，分辨率達微米級別，具有良好的顯微作用，近年來廣泛用于高分辨率的小動物骨骼成像，且檢測的是骨松質 BMD，更能代表骨量變化、可作為臨床前檢測 BMD 的常用方法。
2 骨微結構損傷檢測
2.1 骨組織病理學分析 骨組織病理學分析是評價骨微結構的常用方法，其中蘇木精-伊紅（HE）染色法是應用最廣泛的方法。LIU等給予關節炎（OA）模型小鼠不同濃度的依托昔布（etoricoxib）進行為期 4周的治療，采用HE 染色法檢測脛骨內側軟骨、軟骨下骨及滑膜組織的病理變化，結果顯示，經依托昔布治療后，OA小鼠脛骨內側軟骨下骨的空骨細胞/總骨細胞比率升高，提示依托昔布具有促進軟骨下骨丟失、減少軟骨下骨量的潛在風險。由于骨骼在 HE染色法中需要脫鈣，這使得原有骨組織的邊緣形態常發生改變，從而導致研究者無法準確評估骨微損傷狀態。不脫鈣硬包埋法和活體熒光標記法為其改良版方法，可通過測定不脫鈣骨標本更好保留骨組織微結構，還可得出骨體積比（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、厚度（Tb.Th）、分離度（Tb.Sp）及骨皮質厚度等參數值，定量反映骨微結構變化；同時采用活體四環素、鈣黃綠素在骨重建過程進行熒光標記. 從而觀察骨組織的變化并得到骨動態參數信息。
2.2 掃描及透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（SEM）是一種高分辨率的3D技術，可同時令骨細胞及其所在基質成像，具有制樣簡單、放大倍數高、圖像分辨率高、景深大等特點20世紀70年代開始，SEM就已應用于骨微結構的檢測中，目前采用SEM檢測骨超微結構的技術已十分成熟。透射電子顯微鏡（TEM）可穿透骨組織樣本，直接觀察到骨膠原纖維、骨細胞形態及細胞內部構造，但骨骼切片樣本必須非常薄（50~100mm），制樣過程相對復雜。近年來，研究者常將兩種電子顯微鏡聯合使用，如PROKOPOWICZ等采用掃描透射電子顯微鏡（STEM）與SEM等方法探究在抗癌藥物多柔比星應用下，一種有效的藥物傳遞系統再羥基化類纖維（SBA-15-R）的骨礦化能力，于STEM和SEM鏡下可觀察到，SBA-15-R在模擬體液中浸泡7d后，其表面形成了富含鈣的無定形磷酸鈣層，且分別在14d 和21d后轉變為羥基磷灰石和骨樣羥基磷灰石，上述結果表明SBA-15-R具有骨礦化潛力。綜上，電子顯微鏡憑借放大倍數大、分辨率高等特點在骨微結構評價中占有天然優勢。
2.3 Micro-CT 除上文闡述的BMD檢測，Micro-CT還可檢測的指標有骨體積與骨表面積參數如骨體積（BV）、骨表面積（BS）、BV/TV和骨表面積體積比（BS/IV），骨小梁參數（Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp）和骨皮質參數等GOMES等采用Micro-CT評價阿侖膦酸鈉（ALN）對雌激素缺乏大鼠輻照后骨微結構的影響。Micro-CT結果顯示，經X射線照射7d后大鼠的后肢皮質骨厚度增加，照射30d后骨單位長度與Tb.N減少，Tb.Sp增加，而AIN可緩解X射線照射的有害作用，抑制Tb.Sp增加和Tb.N減少。ABU等*采用Mirco-CT評價抗抑郁藥舍曲林（5mg·kg’·d/l，2周）對鈦種植體骨折大鼠骨愈合的影響，結果顯示舍曲林組大鼠較生理鹽水組大鼠的BV/TV與Tb.N 顯著下降、Tb.Sp顯著增加（P<0.05），結合其他結果提示舍曲林能抑制該種植體的骨愈合能力。目前Micro-CT已成為評價小型動物骨標本和大型動物離體骨微結構的“金標準”。
2.4 核磁共振成像（MRI）技術 MRI具有無創傷、無電高招美，氧同時漢貨當質臂部骨小意微結構的休點，已成為臨床中評齒骨質慧塑骨析風險的重要方法（。GBENELD等（2早在 20世紀0年代就比較了X材線振形找術、CT 租MI評骨骨膜及應模式和滲造性皮質融壞、極蝕、擴作、連綜性及骨的外鈣化的情況，結是某求 M5唯一的缺點是教塑織鈣化型度是感利。沉年毫，一種令段柜囊批都直飲億（WB-A服》被廣經院用于診斷實體箱、淋巴增圖多發性骨髓制及機關藥效評價。日有，隨布高場刻場高場M園掃搞億的日登菁及，大大減少了M園體素的大小利掃持時間.可戲彩的部位色從院和園關節訪端發展別駁骨五端、酸情訪端、限關節等全身骨雪. 研究者們不億可運用MI對骨質紙松簽患者的骨雪遺行全到研究，還可為抗骨質疏松鈣物的數評骨與骨毒性風險訊齒括拱有利每助。
3 骨須度檢測 骨強度指合理的骨力學幼構，包括骨的質量與散日兩個方面到.可變用三點彎南法等方法∶遍過檢測一系列的骨生物力學參數對動物的骨須變進行謂情，主購的檢測推標有彈力模量、最大有氧、最大廢力、融壞有載等=。KND等作報焙苯妥真、知巴噴丁及左乙控西擔三種抗額糊衍物對大鼠骨強度，骨情刻骨代副的服響時，任日圍置給子大躍蘇妥系（2m租·kR入知巴噴丁（30或150mn·k局>左乙拉西擔（50或20mr·kRλ連綜12劇。對大息膠骨進行骨組織彩態學檢查，對取骨劑酸情進行BD檢測.為實用三點考斷評估大窩酸情須度，檢測拖標為最大載有量、斷裂纜，彈力校量。結運緊常苯妥系組大鼠取情的最大負氧，斷裂能、治力想量控自就順閥大基是著下脈（P-0店》.這泰明菜妥系組大鼠的酚骨須度果著降低;到左乙挖N超如巴噴丁維大鼠的生物力學參散與它白對酮練大鼠相比無明某患異.包知巴酸丁維大鼠與白對顆組大鼠相比其BVTV第減小.ISn第增如.骨秘或標物減少。破骨解胞數量增知，結是表明長朝號露于知巴喲丁的大基可索有情W度刻BMD座低的風險。同柳，刻上述知巴隱丁維大鼠的情組的形態幼是類創，有研文報蓮稱在骨質延松大鼠悅型中.大鼠的BD 刺骨組夠形態學參戴發生了某著變化，包彩用三點彎南法測授的骨力學參數卻沒有明緊變化，分析翠圓可能是電于三點考油法檢測的是骨皮質的力學參數行性，耐措質疏松中發生客針零登竹松質切I.
4 臂代附相標檢測
臂代融指標和揚評需代附調五報標、骨轉化生物標老物（BTM入激素與解熟因子等。日有在臨宋中主要用于骨代明核制的劑助斷及相關藥物的療效系測。在臨床有，骨代喇指努色可成為有利的骨毒性評你報標，其中BTM 改行異、快速、簡怎的優點有別作為單感的骨毒性評骨指標用于物臨床租骨毒性謂骨，其又分為形或標老物料骨喝標老物網大亮。
4.1 骨形成生物標老物 1型胺槳占骨有機基質含量的2%，當1型漿胺槳從或骨細離分紙到離外介是時，其河哥編圖取基端租胞檢行異性酶切下，即為1型漿胺槳N編角素（PEP》與1型槳胺槳C端稍票（PCPλ，除少量沉積在骨基質中，大部分進入血液精環.園戴 PEP劑PCP的含量升高能說明1系胺聚合減違率如快，骨形成活躍。其中PEP是國際骨質疏松基金會及實驗室醫學取合會推薦最較感的骨形成生物標老物。P服R\EDN等（=研災了書馬兩平（下m·k*入網戊糧的（30m·k*入左乙控園坦（150 mR·b*》對正常劑去部集Wistar 大鼠膠骨骨第、腰推和股骨短編 BAD 和微結構的羅響，每日滿胃治藥，連綜10周，檢測大窩愈清中PDP的本平。結是某示，治子卡馬西平與限酸鈉的大款血清中的PDP水平按正需對朋組是著降低（P<Q0）授示這種物可能具卻制大鼠骨形成的風險。骨鈣素（α》由成骨潤圖合成與分泌. 是骨瑟質中最本育的豐胺旱汞白。當成骨鮮圖分餐出 α后，大部分α測積在情基質中，小部分進入血葡環;當骨琴質序解時CC便進入愈附環中，故CC位能及映骨轉狀車。滿性疏酸酶（ALP》分布于情、肝刻小弱等部他，故用以病骨形成狀茶的粹異性利使。骨行異性減性動順期（BUP》相對于從P的排異性更高，BUP能促進骨基質動沉積、加強骨基質礦化。
4.2 骨吸收標老物 抗酒石酸酸性疏酸酶（TRACP》是維一一種由武骨煙粕分德的情吸收標老物，此外，TACP 還存在于巨噪闊胞、血小板、江闊胞等。TJCP有肉種糖基化形式，即抗消石酸酸性動酸酶5∶（TRACP5a》抗消石酸酸性動酸酶 品（TBPACP-品>.TNCP-E 主要來象于數性巨顧細陷，TAGP5b主零毫象于酰情算離.故可監用TCP-a 了解不例理理條件下的生物偉臂代排供漢婦LO等-常胃給子維性SD大款雷公磨甲素15μF b*·d，連緣8周，按雷公第甲素對大息骨警的非響，采用MeroCT檢測大鼠腰推BD 及骨賣構，房檢測大款愈漿中TRACP-5b 劑OC水平，納屋是稱需公酶甲素組大鼠血漿的TR.AGP-5b水平與空自對秀隨大鼠相比顯著升高，面破骨細胞數量是著降每，結合 McpCT的結屋初步表明雷公哪甲素在一定程度上耳以抑制函骨煙粕形或，對骨素失具有保護作用破骨解胞分經的TRACP 和組織蛋自 K不億破壞骨瑟質，還能磚壞成 1型胺腺的三螺跑結構，釋放w基刻漢基癌營調食濟中，惠 1型家院缸基幅匙刻購基編素（ND4與CTW λ其中CTXI是最觸感的骨吸收生物標老物。戴外，Dpr與Fyr色是破骨細胞內解 1型胺脫纖維時的解產物，不液肝臟碎解直接排重于果中.園戴檢測Dpyr與Pyr的樣本為生物體的綠液。
藥物骨毒性作用機制
1 Wnuβ-痊環蛋自（β-ctrrin）們號通路 Wnu β-aenin 信號通路是一個復雜的蛋白作用網絡，研災表明咳信號通路中 重us 基及其配體、β-catrnin、成骨行異性轉錄園子（Bur2》表迄與功能的改變，將影響成骨解胞的增殖、分化，能到影響情基質的彩或劑礦化。研災某術Wnuβ-ctrrin 何號通商的許多基吸變州代聘核制有關，如在先天性因酷切斷綜合架（毒教股碳》泰者中發理Ea3基園突變. 在 XV型成骨不全架相早發性情質政松中發理Eai 基因突變這也為抗骨質疏松藥物開發授情了新充點刻要路。如全球首款配向骨燙化盂白的人象化lnC2單克降抗體rersrur山.可通過闡斷骨燙化蛋自LRP-5用（Wnt受體》著齊，餐進新骨形成為減少骨吸收，用于絕經后掃女及老年男性骨質疏松的第療。β-utmnin是Wrf-aturin們號遍路的中心配石劑意要或分，其功窗缺失持金形響或骨煙彩的增殖、分化與或著，為座低款骨組離的端殖分化，使次級骨化中心彩成減授進到影響骨生長（。Bur2可誘導或骨煙陷分化為增如主或清或骨閣離款量，選到刺激 α、1型胺漿，骨檢正白和醫翠牌的移轉錄。MU等研究乙融噪酸（AZ》對為節貨模型大鼠的韻療作用及機制，癸用 Wexrnbldx法檢測Wnu β-ctni 差齊關鍵成員的蛋白體平.納吳表明AZ可序低都膜維幟中Wntl，β-cutrin，郭物基園（ceye>刻基質金屬蛋白酶2（MEP9）等盂白水平，為授高糖翠合成酶激酶3β（GSK-第》的水平。副AZ與Wnufp-ctnin 避路顏活劑氧化蒙用，上述狀況得列了漁轉。
綜上，Wran-trrin們號通路參與骨形成，測控骨代圍達程，濕入了解壓何號通路除了纜液增知研究都對于骨瀝發育和骨穩態的了解，還有盟遍過骨雪發育異常停另頻公新研物配5的潛在骨毒性。
2 核園子xB受體激測圓子配體（BANL》1枸圓子xB受體需化園子（RANK》1骨保護蛋白（OFG）銷號通路 PNL假KCFG通路是腫削壞W頁子團家練的一部分，存在于多種都官中。20其紀9 年代質實發理逐們號測高在調節骨重想，黃骨鯛離的形或與分化改及多種制理挖態中配看重要作用。BNK在破骨細陷有體表到高度表造.與BANKL結合后，能夠餐進員骨細陷分化減著。RkL 由或骨潤圖產生，當粥酸依頓淋巴煙離激活為受明骨喝紋制酸時，破骨細熟利體報紋別RNK與BANK 的合們號，餐進武骨細胞有體深融骨細陷路分化。副CPG作為BANKL的繡飼受體，由骨基質細離相成骨解胞表選.可同止BANK 劑BANKL結合，ORG 不億可同新歌骨煙陷分化，還策構制或著武骨解彩的存活及骨吸飲需性。由于這一符性，研究者們已u骨組期中或功分離路 CFG為或人壹簡骨限護素用于絕經后掃女骨質躍松的的療。另有研究表明. BNK0FG比例增高會餐進破骨細胞分化與骨丟失，羅響園索包括長朝服用糖業質激索，免疫抑制劑、輝激考缺乏劑桿候琴露于甲狀勞零激素;服用每激素如師二醇、雷濟著秀，琴露于雞料木素以及增如械發變等情況低B測NKL0FG 比例（-l。R測NK1 BNKOFG遍路及其與多種細粕園子圖鈣調教素在調行勞骨酒狗形直中的機吃作用，為選一步了解骨是疾松、摩發性骨腫增塑約風濕關節數等骨代附核制的理生理學授情了標要路（4。日利針對濱們號路的研物如BANKL的單克抗體地漸單抗（derronrs）已被找用于的療骨質政松安和錯腫喘疾病=!
3 其物們號路 研窩表骨彩態發生戲白-2（BP-2）Ana何號通路模卻制耳餐進骨煙彩亡，到在體內實驗中發現中減藥骨砥康能押制去和染大鼠骨潤胞測亡，其主數通過上調 BP2、pSnad 殘自p-Sasd5 蛋自，或骨相關轉錄園子抗體（cdurix》Bnr2表造. 加強BF26eat路的信號表i，為測過上調拉測亡蛋白，下調測亡滅白含景，從副規制組離%亡（一。另有要區表明骨質政松與糖果病存在的眼票可與p3挖裂槳活化蛋白激酶（p38AAPK》1試氧化物解體增殖活化受體y共酸活園子-1a（PCC-1a）1 葡鳥糖運蛋自 4（QUT）停號遍路有關-。戴外. 住有研文表明經典的粕外調節蛋白酸酶（EK），cJun 氨基米編激期（JNK）們號路色與骨鋼鐘害相式（1 總填 日稍高四尚關建文一套標準的傷物骨毒性檔床耐評價方法.隨著人用藥品注冊找術要求國際協調會（CH>關于骨質政松我物臨床病評臂方法指導陽副的落地.從中可息EMID仍搭是評位有物骨毒性的理想報標;高低電子顯費鏡與各類形像學找術使骨組織私態學檢測法授詞了薏動發展;骨力學參數可補無 BD與骨組的零態學評特的不足;骨代圍指努可便燒、靈較，快速地區映機體內骨代喇擾態，尤其是BTM.可揮助臨床醫生診斷骨代副校制為察測衍物療資，鋼息受調檢測有法，億系，人簽的酸響、龍外，很入了解 Wr-atrin 刻B出NRAMK0FG節們號遍路.可從機制層到為預物情毒性評快授情更多的思路，為可遍過這些路中師常移預測暢衍的潛在骨毒副作用。綜上;我們應對存在骨毒性潛在風險的藥物概高警惕，關注巧物骨毒性臨宋酮評骨方法，減少臨床用產R患。
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