不同方法建立長期慢性高尿酸血癥模型及對相關(guān)并發(fā)癥影響的研究進(jìn)展

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2022-05-18

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隨著發(fā)病率的逐年升高∶HUA長期慢性所伴隨的并發(fā)癥問題亦浮出水面。當(dāng)前，大多數(shù)動物模型僅用于短期降尿酸修選，關(guān)于其長期并發(fā)癥甚少

　　摘要∶
　　高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA））在人類中具有較高的發(fā)病率，且其與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、心血管疾病以及肝腎功能損傷等多種疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。實(shí)驗動物研究顯示，HUA 相關(guān)并發(fā)癥需要長期穩(wěn)定的誘導(dǎo)過程。
　　與人類不同的是，常用模式動物具有較高的尿酸酶表達(dá)，可迅速將尿酸分解成可溶性尿囊素排泄出體外，該特點(diǎn)易造成造模期間高尿酸日均暴露時間不足。因此，HUA 相關(guān)并發(fā)癥的觀察對實(shí)驗?zāi)Ｐ驮谀Ｊ絼游?、誘導(dǎo)方式、高尿酸暴露時間等方面均有較高的要求。
　　本文對HUA 動物模型造模方法以及不同造模方法對慢性并發(fā)癥的影響進(jìn)行綜述，重點(diǎn)從主流藥物造模方法的優(yōu)劣分析、模式動物的選擇、基因干預(yù)造模3個方面展開，為HUA 長期并發(fā)癥研究的造模方法選擇提供參考依據(jù)。
　　關(guān)鍵詞∶
　　高尿酸血癥（HUA）;造模;并發(fā)癥
　　高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是機(jī)體內(nèi)尿酸生成過多或/和排泄障礙造成的尿酸體內(nèi)積聚的現(xiàn)象。2019 年中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會發(fā)布的《中國高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南》指出，非同日、2次空腹血尿酸大于420 umol/L（成年人，不分男性、女性）即可診斷為HUA。國內(nèi)外流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，HUA發(fā)病率呈逐年升高且年輕化趨勢。長期HUA 可誘發(fā)多種并發(fā)癥，如痛風(fēng)、II型糖尿病、心血管疾病、肝腎功能損傷等。當(dāng)前應(yīng)用的HUA動物模型大多數(shù)為考察尿酸體內(nèi)生成和排泄，這僅需要動物短期維持高水平尿酸即可達(dá)到研究目的。然而，HUA相關(guān)并發(fā)癥是長期高尿酸慢性誘導(dǎo)作用下的結(jié)果。為更真實(shí)模擬和研究人體 HUA并發(fā)癥的病理誘導(dǎo)過程，構(gòu)建長期、穩(wěn)定的HUA動物模型顯得尤為重要。本綜述從主流藥物造模方法、模式動物選擇和基因干預(yù)造模3個方面，對當(dāng)前HUA 模型構(gòu)建方法的長期應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)劣評價，并展望新型模型和技術(shù)的未來發(fā)展方向，為今后 HUA長期并發(fā)癥體內(nèi)研究的模型選擇提供參考。
　　1 主流藥物造模方法的優(yōu)劣分析
　　1.1 用于HUA 造模的藥物及其作用機(jī)制
　　當(dāng)前，大部分實(shí)驗使用較多的造模方法仍是以通過藥物干預(yù)為主的方式增加尿酸來源、抑制尿酸代謝及排泄，主要造模藥物包括氧嗪酸鉀（（potassium oxonate，PO）、次黃嘌呤（hypoxanthine，HX）、腺嘌呤（adenine，AD）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）、煙酸（nicotinic acid，NA）、果糖（fructose，F(xiàn)RU）、酵母（veast.YE）等。文中匯總了這些造模誘導(dǎo)劑的機(jī)制、給藥方式，并對成模性進(jìn)行評價（表1）。根據(jù)造模藥物的作用機(jī)制，現(xiàn)有的研究提示，基于氧嗪酸鉀和次黃嘌吟的模型更有利干評價尿酸的生成以及重吸收.而基干腺嘌呤的模型更有利于評價HUA下的腎臟損傷及干預(yù)保護(hù)，基于果糖的模型更有利干評價 HUA 合并糖尿病等代謝性紊亂的機(jī)制及改善效應(yīng)。單獨(dú)應(yīng)用乙胺丁醇及煙酸誘導(dǎo)HUA鮮有報道，其常與外源性尿酸前體物質(zhì)聯(lián)合誘導(dǎo)。
　　1.2 聯(lián)合造模在慢性 HUA并發(fā)癥中的應(yīng)用
　　HUA并發(fā)癥的自發(fā)性誘導(dǎo)需要維持組織器官每日的高尿酸暴露時間以及誘導(dǎo)周期。由于非靈長類哺乳動物大都表達(dá)尿酸酶，當(dāng)誘導(dǎo)劑代謝或排泄后，實(shí)驗動物體內(nèi)的尿酸水平迅速回落。單一誘導(dǎo)劑往往難以觀察到并發(fā)癥現(xiàn)象，在當(dāng)前研究中，人們常常需使用兩種以上的聯(lián)合造模劑誘導(dǎo)組織器官的慢性病變。聯(lián)合藥物誘導(dǎo) HUA 并研究其并發(fā)癥的模型較多，并無均一標(biāo)準(zhǔn)，鮮有文獻(xiàn)系統(tǒng)性評價方法的適用性。我們整理了現(xiàn)有聯(lián)合造模誘導(dǎo)方法對尿酸水平以及并發(fā)癥的誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合造模模型藥物選擇中，氧嗪酸鉀是絕大多數(shù)實(shí)驗的選擇，其聯(lián)合腺嘌呤、次黃嘌呤、酵母膏在尿酸升高倍數(shù)上均有較好的表現(xiàn)。但是，當(dāng)前關(guān)于HUA并發(fā)癥的研究多集中于腎臟損傷，對其他組織器官損傷的模型探索較少。
　　2模式動物選擇
　　由于生理病理過程與人類相似且飼養(yǎng)方便，大多數(shù)研究選擇嚙齒類動物作為HUA 的模式動物，包括SD大鼠、昆明小鼠和C57小鼠等。然而，不同于人類的是，這些動物均能合成尿酸酶，在體內(nèi)將尿酸代謝為可排泄的尿囊素。這一特征正是當(dāng)前藥物誘導(dǎo)劑造模難以保證組織器官長期持續(xù)性高濃度尿酸暴露的原因，這亦使得相關(guān)并發(fā)癥難以被觀察到。
　　相比而言，禽類的嘌呤代謝途徑與人類更為相似，其僅需在基礎(chǔ)飼料中添加次黃嘌呤、酵母等尿酸前體物質(zhì)或腺嘌呤影響尿酸排泄即可誘導(dǎo)穩(wěn)定的 HUA 模型。當(dāng)前，常用的以禽類為主的 HUJA模型主要選擇雞或鵪鶉作為模式動物。在雄性迪法克鵪鶉飼料中添加 15g/kg 的酵母粉，飼喂140天后血清尿酸水平顯著性升高，在第60天時研究人員可檢測到血清甘油三酯水平的顯著性上升，第 90天時血清葡萄糖水平呈現(xiàn)顯著性上升。同時，該模型中血清黃嘌吟氧化酶以及胰島素水平均顯著性升高，這是機(jī)體氧化應(yīng)激以及胰島素耐受的表現(xiàn)，也是多器官損傷的病理基礎(chǔ)。然而，在該研究總計140 天的實(shí)驗周期中，肝腎功能的顯著性變化并未被觀察到P39】。該模型的規(guī)律與人類飲食結(jié)構(gòu)規(guī)律改變類似，可用于模擬自然慢性損傷，其存在實(shí)驗周期過長的缺占。近年來有研究表明。在高脂高嘌吟飲食的基礎(chǔ)上皮下注射氧嗪酸鉀200 mg/kg 可進(jìn)一步提升鵪鶉血清尿酸水平約1.5倍，且在 14 周后可觀察到主動脈壁的脂質(zhì)次積、斑塊形成。以人及腎小球的脂質(zhì)匯和和腎小管的空泡戀性。這文說明通過進(jìn)一步提高尿酸水平可加速 HUJA 并發(fā)癥進(jìn)程。然而，當(dāng)前大多數(shù)實(shí)驗室缺乏進(jìn)行禽類飼養(yǎng)的條件，在模型推廣上或許有一定難度。
　　近年來，基于斑馬魚的疾病模型受到廣泛關(guān)注，斑馬魚與人類基因高度同源，生物結(jié)構(gòu)與生理功能和人類亦高度相似，且其有易于繁殖、實(shí)驗周期短、實(shí)驗藥量小、給藥方式簡單的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前，基于斑馬魚的HUA模型尚處于摸索的起步階段。研究顯示，使用200 μmol/L 氧嗪酸鉀聯(lián)合 10umol/L黃嘌呤可提升斑馬魚體內(nèi)尿酸水平約2倍，該方法可作為急性HUA 模型，該模型可應(yīng)用于化合物的降尿酸效果的快速評估。然而，作為新興模式動物，當(dāng)前斑馬魚的 HUA造模方法缺乏長期慢性狀態(tài)下的有效性評估。
　　靈長類動物的尿酸合成代謝途徑與人類最為相似，但由于其飼養(yǎng)難度大以及實(shí)驗成本高昂，鮮少用于HUA 相關(guān)研究。近期研究顯示，給予雄性恒河猴 200 mg/kg 肌苷腹腔注射1 h后，血清尿酸濃度提高約4倍;然而，4 h 后血清尿酸即回落至基線。該方法并不適用于長期慢性 HUA 及相關(guān)并發(fā)癥影響的評估。
　　3 基因干預(yù)造模
　　3.1 當(dāng)前針對HUA的基因干預(yù)靶點(diǎn)
　　尿酸在動物體內(nèi)可在尿酸酶作用下降解為可溶性尿囊素排出體外，或通過腎臟和腸道排泄。因此，當(dāng)前基因干預(yù)靶點(diǎn)主要分布于編碼尿酸酶的 UOX（urate oxidase）、負(fù)責(zé)腎臟重吸收的 URAT1（urate transporter 1）和 GLUT9（glucose transporter 9），以及負(fù)責(zé)腸道排泄的ABCG2（ATP-binding cassette transporter; subfamily G，member 2）。近年，基于全基因組關(guān)聯(lián)的研究顯示，GLUT12（glucose transporter 12）是一種生理性尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能障礙會導(dǎo)致血尿酸濃度的升高，提示其或許可以作為新的干預(yù)靶點(diǎn)。此外，在腸道排泄中，PDZK1（PDZdomain-containing 1）和 ABCG2 的表達(dá)高度相關(guān)，敲除 PDZK1 可間接性導(dǎo)致ABCG2 的表達(dá)同步下調(diào)，進(jìn)而減少尿酸腸道排泄。3.2 基因干預(yù)對尿酸水平的影響
　　如表3所示，當(dāng)前研究中針對HUA的基因干預(yù)造模所選用的小鼠以C57BL 系列為主，不同基因的敲除對于模型動物的獲得數(shù)以及尿酸水平的提高具有較大差異。UOX敲除口|以何得血尿校水平大幅升高，然而其死工率也較高。因此其操作性并不強(qiáng)。IRAT1的高除并不能使得尿酸水平顯著性升高，因此不適用于建立 HUA模型。GLU79 的敲除，在系統(tǒng)性敲除和特定組織器官敲除中具有不同的效果，系統(tǒng)性敲除GLU/79具有胚胎致死性，而肝特異性敲除則沒有，且可大幅升高血尿酸濃度。
　　3.3 基因干預(yù)誘發(fā)的急慢性并發(fā)癥
　　早在 1994年就有研究者利用胚胎干細(xì)胞同源重組的方法構(gòu)建UOX基因敲除小鼠，在5 思齡OX鼓除小鼠的腎臟中可見大量尿酸結(jié)品以及腎小管急性萎縮，這也是誘發(fā)小綠大量死亡的原因。近年，有研究者通過 TALEN 技術(shù)進(jìn)行雜合子敲除，然后將敲除后的小鼠交配獲得U/OX純合小鼠，這種方法提升了小綠存活率，這些小鼠均表現(xiàn)出顯著的腎功能障礙，其中雄性小鼠伴有顯著性的胰腺損傷以及胰島素分泌受損，而雌性小鼠伴有高血壓以及脂代謝障礙。在UOX敲除的雄性小鼠中，輔以鏈脲霉素飼養(yǎng)可加速胰島β細(xì)胞損傷及誘導(dǎo)糖尿病5。
　　在雜交獲得的系統(tǒng)性 GLUT9基因敲除小鼠中，研究者觀察到腎臟中梗阻性結(jié)石、腎小管間質(zhì)炎癥和皮質(zhì)的進(jìn)行性炎癥纖維化，以及經(jīng)度腎功能不全5!。與此不同的是，在肝臟特異性敲除 GLU/T9 后，里然尿酸水平出現(xiàn)大幅升高，但并無顯著性的腎臟以及心血管損傷51、5∶在腸上皮細(xì)胞特異性敲除 GLUT9后，機(jī)體出現(xiàn)脂代謝紊亂、血壓升高以及心臟重構(gòu)的現(xiàn)象。另有研究顯示，條件性誘導(dǎo)腎 GLUT9 敲除1周后，收縮壓和舒張壓雙重下降，同時心率升高。
　　4 展望
　　隨著發(fā)病率的逐年升高∶HUA長期慢性所伴隨的并發(fā)癥問題亦浮出水面。當(dāng)前，大多數(shù)動物模型僅用于短期降尿酸修選，關(guān)于其長期并發(fā)癥甚少。雖然藥物聯(lián)合模型在長期慢性 HUA中具有良好的表現(xiàn)，但器官損傷也多集中于腎臟，對其他如心血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)并發(fā)癥鮮有提及。建立合適的長期藥物造模方法并系統(tǒng)性評估其對多種慢性并發(fā)癥的影響，對今后HUA 相關(guān)研究的發(fā)展具有良好助力。
　　當(dāng)前，大多數(shù)實(shí)驗室主要選擇小鼠或大鼠進(jìn)行HUA模型構(gòu)建，而嚙齒類動物由于表達(dá)尿酸酶并不是最佳的 HUA 模式動物，因此，今后研究人員可進(jìn)一步推動其他模式動物如禽類在 HUA 相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。由于飼養(yǎng)便捷且廉價，斑馬魚被廣泛用于藥物篩選實(shí)驗，但其在 HUA 上的方法建立尚不成熟，在未來條件優(yōu)化后或許會有良好的表現(xiàn)。
　　通過基因干預(yù)誘導(dǎo) HUA模型是今后重要的發(fā)展方向。在當(dāng)前研究中，UOX 敲除可引起尿酸水平的顯著性升高，然而其死亡率高且子代獲得困難。其次為 GLUT9，尤其是肝特異性敲除GLUT9后，實(shí)驗動物在存活率以及尿酸升高倍數(shù)上均有良好表現(xiàn)。其實(shí)，無論是何種敲除，均需考慮該基因及尿酸水平對胚胎發(fā)育的影響，在未來條件性誘導(dǎo)敲除或許是解決胚胎致畸致死或成年前死亡率過高的發(fā)展方向。