通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步探究紅曲治療腦小血管病（CSVD）的作用機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：

2022-05-23

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本研究結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)紅曲可能通過(guò)調(diào)控 PI3K/AKT/mTOR通路改善CSVD模型大鼠的癥狀，為紅曲的臨床應(yīng)用提供依據(jù)

　　摘要∶
　　腦小血管病（CSVD）是直徑介于40～200 μm 的腦血管病變引起的綜合征"1，臨床表現(xiàn)為腦白質(zhì)病變、腦微出血、腔隙性梗死等。研究表明，CSVD與癡呆、卒中等疾病關(guān)系密切，約有45%的血管性癡呆和20%的缺血性卒中由 CSVD引起。西醫(yī)治療CSVD主要通過(guò)溶栓藥、降壓藥、抗血小板等早期干預(yù)，效果不佳且不良反應(yīng)較大。中醫(yī)理論認(rèn)為CSVD屬"絡(luò)病"范疇，治法為扶正祛邪，中藥治絡(luò)病效果顯著，不良反應(yīng)較少，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
　　紅曲（red yeast rice，HQ）為藥食兩用中藥，生產(chǎn)歷史悠久，藥用記載始干《飲膳正要》。2020年版《中國(guó)藥典》5記載紅曲為紫色紅曲霉Monascus purpureus Went 寄生于粳米發(fā)酵而得。其味甘，性溫，無(wú)毒、歸肝、脾經(jīng)，有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)功效。現(xiàn)代藥理研究表明，紅曲成分中Monacolin K及其衍生物、紅曲色素、y-氨基丁酸等具有顯著的降血脂、降血壓、神經(jīng)保護(hù)、改善微循環(huán)等作用，提示紅曲可作為治療 CSVD的潛在藥物。
　　網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、藥理學(xué)等的綜合性學(xué)科，通過(guò)構(gòu)建生物分子互作網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)化詮釋分子作用機(jī)制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法構(gòu)建紅曲"藥物-成分-靶點(diǎn)"網(wǎng)絡(luò)，獲取相關(guān)成分、靶點(diǎn)、通路信息，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討紅曲治療CSVD的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。
　　目的
　　通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步探究紅曲治療腦小血管病（CSVD）的作用機(jī)制。
　　方法
　　通過(guò) PubChem、SwissTargetPrediction等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取紅曲成分及作用靶點(diǎn)，運(yùn)用GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取 CSVD的疾病靶點(diǎn)，結(jié)合Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建"藥物-成分-靶點(diǎn)"網(wǎng)絡(luò);取交集靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò);利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG分析。建立大鼠CSVD動(dòng)物模型，通過(guò)Morris 水迷宮、HE染色、ELISA、Western blot等驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果。
　　結(jié)果
　　篩選出43個(gè)活性成分，37個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，GO 分析結(jié)果涉及神經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖等，KEGG結(jié)果涉及 PI3K-Akt和RAS信號(hào)通路等;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅曲干預(yù)后可顯著改善CSVD大鼠海馬CA1區(qū)損傷，降低血清中IL-6、IL-1βB、TNF-α炎癥因子水平，上調(diào) PI3K/AKT/mTOR蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　本研究結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)紅曲可能通過(guò)調(diào)控 PI3K/AKT/mTOR通路改善CSVD模型大鼠的癥狀，為紅曲的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　關(guān)鍵詞∶
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);紅曲;腦小血管病;分子機(jī)制
　　討論：
　　CSVD是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，與高血脂、高血壓等危險(xiǎn)因素關(guān)系密切。中醫(yī)理論尚未明確定義CSVD、通常認(rèn)為其屬于絡(luò)病，病位在腦，由濁邪入血，入髓傷髓所致。臨床治療CSVD應(yīng)以活血化瘀、化濁益髓的中藥為主1。紅曲具有活血化瘀、健脾消食的功效，臨床上常用的中成藥血脂康、脂必妥均以紅曲為主要成分，廣泛用于治療高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管病等，可作為治療CSVD的潛在藥物。
　　本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選獲得Monacolin K、Ankaflavin、GABA等43個(gè)紅曲活性成分，PIK3CA、MTOR、MAPK1等1126個(gè)腦小血管病靶點(diǎn);PPI網(wǎng)絡(luò)分析共發(fā)現(xiàn)91個(gè)節(jié)點(diǎn)，752條邊，平均Degree值為16.7、獲得EGFR、MAPK1、ESR1等37個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn);GO分析結(jié)果涉及171個(gè)生物過(guò)程、33個(gè)細(xì)胞組分、51個(gè)分子功能，主要涉及神經(jīng)炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖等。研究表明，神經(jīng)炎癥在腦血管疾病的發(fā)展中起重要作用，降低相關(guān)炎癥因子如TNFα、IL-6、IL-1β等水平，可改善血腦屏障通透性，減輕腦組織損傷促使大腦結(jié)構(gòu)功能恢復(fù)正常。KEGG分析結(jié)果得到104個(gè)通路.主要有PI3K-Akt、Rapl、RAS 通路等.P3K-Akt通路研究較為廣泛，其在腦卒中、血管性癡呆等疾病的治療中起著重要作用。Qi等研究發(fā)現(xiàn)3-丁基苯酞（NBP）能通過(guò)激活 PE3K/Akt信號(hào)通路抑制CSVD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)細(xì)胞基本功能，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Cha等1研究表明人參皂苷Rg，可通過(guò) PI3K/Akt mTOR 信號(hào)通路增加缺血性卒中后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腦內(nèi)血管生成，改善腦血流量。
　　本研究選擇不同劑量紅曲干預(yù)CSVD模型大鼠，探究其作用機(jī)制，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅曲能顯著縮短CSVD大鼠的逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù). 表明紅曲顯著改善CSVD模型大鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力;HE病理切片結(jié)果顯示紅曲治療組大鼠海馬CAl區(qū)細(xì)胞形態(tài)完整、排列整齊，核仁和胞漿界限清晰，不同劑量紅曲治療組海馬 CA1區(qū)病變程度均有明顯改善，高、中劑量效果較為明顯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)GO分析結(jié)果表明，紅曲治療CSVD可能與神經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖、信號(hào)較導(dǎo)等生物過(guò)程相關(guān)，其中神經(jīng)炎癥在CSVD發(fā)展過(guò)程起重要作用。生化指標(biāo)結(jié)果顯示∶不同劑量紅曲治療組可顯著降低CSVD模型大鼠血清 TNFa、IL-6、IL-1β炎癥因子水平。其效果呈劑量依賴性;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示紅曲中 Moracolin類、紅曲色素等為其活性成分，本研究結(jié)果中紅曲能顯著降低TNF-a、ⅡL-6、IL-1水平可能與上述成分有關(guān)。KEGG分析結(jié)果顯示.涉及CSVD的有PI3K-Akt、RAS、Rapl信號(hào)通路等。研究表明 PI3K-Akt信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)下游把蛋白mTOR活性。參與自噬清除β淀粉樣蛋白的沉積、恢復(fù)細(xì)胞功能等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用12-1網(wǎng);Western blot結(jié)果表明.與假手術(shù)組相比.模型組PI3K、AKT、mTOR蛋白水平顯著降低∶ 與模型組相比.紅曲治療組可不同程度增加 PI3K、AKT、mTOR蛋白水平.提示紅曲可通過(guò)上調(diào) PI3K/AKT/mTOR蛋白的表達(dá).參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞增殖、分化、凋亡等發(fā)揮治療CSVD的作用。
　　綜上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，構(gòu)建紅曲治療CSVD的成分、疾病、作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，展現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療優(yōu)勢(shì)。通過(guò)Morris水迷宮，海馬組織HE染色.TNF-a、IL6、IL-1β炎癥因子檢測(cè)，PB3K、AKT、mTOR蛋白測(cè)定等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果.初步揭示了紅曲治療 CSVD的藥效機(jī)制，可為后期深入探究其治療CSVD機(jī)制提供理論依據(jù)。