教您實驗原理及步驟關(guān)于慢病毒感染細胞教程詳細講解

發(fā)布時間：

2021-12-13

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慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞

　　1. 實驗原理
　　慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達。
　　所以，在體外實驗及體內(nèi)實驗的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在獲得越來越廣泛的應用。
　　2. 主要材料
　　細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-鏈霉素溶液、慢病毒、Polybrene助轉(zhuǎn)染試劑
　　3. 主要試劑配制
　　（1）PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，121℃，30min，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 　　（2）細胞生長培養(yǎng)液：臨用前根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，再按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
　　4. 實驗步驟
　　（1）胰酶消化細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為0.5~1×105/ml（根據(jù)情況酌情調(diào)整），每孔200ul細胞懸液接種至24孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日進行慢病毒感染，此時細胞的融合度約為70%左右。
　　（2）準備病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬時離心機離心20秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根據(jù)實驗按照MOI準確計算慢病毒用量，將其稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。
　　（3）根據(jù)預實驗確認MOI=100進行后續(xù)試驗，準確計算好每孔所需病毒原液量。慢病毒使用量=MOI*細胞數(shù)目/慢病毒滴度，吸取病毒液加入細胞中，同時加入5ug/mL的Polybrene助轉(zhuǎn)染試劑，以提高感染效率。
　　注：感染前細胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務必保證加病毒之前，細胞處于良好的生長狀態(tài)。
　　（4）混勻后將24孔板放在37℃度培養(yǎng)箱中孵育。
　　（5）8-12小時以后觀察細胞狀態(tài)。細胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異，表明慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后更換為新鮮培養(yǎng)基。
　　（6）感染48小時后，熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，估計慢病毒感染目的細胞的效率。同時，收集樣本進行后續(xù)實驗檢測。
　　Lentivirus 表達時間較長，但在一般代謝較旺盛的細胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24h后可以觀察到GFP 熒光；代謝比較緩慢的細胞（如原代培養(yǎng)細胞，神經(jīng)干細胞，胚胎干細胞等）GFP 蛋白表達時間較長，感染后72-96h甚至更長時間才可以觀察到GFP熒光。感染后的細胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察GFP的表達時間和表達強度來確定Lentivirus 對目的細胞的感染情況。感染后期請根據(jù)細胞生長的情況對細胞進行及時換液和傳代，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。
　　5. 實驗結(jié)果100X