轉錄因子Cra活性失調導致甘油過量合成是大腸桿菌生長負擔的重要原因
發布時間：
2021-12-14
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課題概述
合成代謝是工程細菌的負擔之一，但其內部機制并不明晰。本研究結果表明轉錄因子Cra活性失調導致甘油過量合成是大腸桿菌生長負擔的重要原因。甘油的合成會降低1,6-二磷酸果糖水平并激活Cra，從而抑制糖酵解相關酶的活性和促進糖異生相關酶活性。由于ATCC細胞生長依賴葡萄糖的供應，糖異生過程的不當激活和糖酵解過程的抑制可能會導致甘油通路誘導作用下損害細胞生長。德國馬克斯·普朗克陸地微生物研究所Hannes Link團隊通過在甘油通路限速酶表達的啟動子中設計了一個Cra結合位點以維持足夠高的1,6-二磷酸果糖水平。作者設計了一組成型的誘導型啟動子，并在大腸桿菌中過量合成了類胡蘿卜素，從而證明了該方法的普適性。相關成果發表在《Nature communications》。
1. 甘油過量合成導致大腸桿菌的生長負擔
為了研究合成代謝途徑如何影響宿主的代謝過程，作者在大腸桿菌中過表達甘油生物合成途徑。甘油通路是從糖酵解代謝物磷酸二羥丙酮開始的兩步反應。第一步反應由3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)催化，將磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油。第二步反應在3-磷酸甘油磷酸水解酶(GPP2)催化下，3-磷酸甘油去磷酸化生成甘油。用于合成甘油的大腸桿菌菌株從質粒中表達了編碼gpd1和gpp2的兩個基因，并缺乏甘油激酶基因(glpK)防止甘油作為碳源被利用。其中gpd1由pBAD啟動子（阿拉伯糖誘導）調控，而gpp2由pJ23101啟動子調控。在生長負擔調控研究中，發現pBAD啟動子能夠線性促進蛋白表達。然而，根據通量平衡分析，pBAD啟動子無法調控生長速率和甘油合成效率。但是，甘油通路誘導作用下，生長速率下降幅度比通量平衡分析要劇烈得多，如圖1所示。
甘油過量合成導致大腸桿菌的生長負擔
2. 甘油合成通過降低1,6-二磷酸果糖水平來激活轉錄因子Cra
為探討導致菌株生長負擔的分子機制，作者對0、0.1 和 0.5%阿拉伯糖誘導下的代謝組變化進行分析。共檢測到96種代謝物，這些代謝物在0.1%阿拉伯糖誘導下保持相對恒定，但在0.5%阿拉伯糖誘導時顯示出強烈變化。其中，0.5%阿拉伯糖誘導時，甘油通路的直接前體磷酸二羥丙酮（DHAP）下降最強烈。此外，磷酸二羥丙酮上游代謝物1,6-二磷酸果糖(FBP)也是變化最明顯的代謝物之一。FBP可激活轉錄因子Cra，進而抑制糖酵解酶相關基因表達和促進糖異生酶相關基因表達。低濃度FBP是否可以激活Cra從而調控基因表達和酶活性。Cra敲除菌株作為對照組，對各實驗組38個蛋白進行分析，發現0.5%阿拉伯糖組磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PpsA）出現顯著上調，而甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GapA）顯著降低。由此說明，0.5%阿拉伯糖誘導甘油通路可降低FBP濃度從而激活Cra，導致GapA活性降低（糖酵解相關酶）、PpsA活性增加（糖異生相關酶）。
由于菌株在含有低葡萄糖濃度培養基里生長，由此假設糖異生激活是生長負擔的重要原因，并進行了證實。此外，在甘油通路高誘導下，Cra敲除菌株比基礎菌株生長得更好。因此，Cra可以調控甘油過量合成造成大腸桿菌的生長負擔。
甘油通路的誘導激活轉錄因子Cra
3. 代謝模型預測甘油合成最優策略
為進一步表明Cra轉錄是調控甘油合成的一個因素，作者開發了一個小型動力學模型。如圖3所示，該模型包含一種代謝物(1,6-二磷酸果糖)和兩種酶(GapA和GPD1)。根據Michaelis-Menten動力學，1,6-二磷酸果糖影響糖酵解和甘油通路的反應速率。作者假設模型中有恒定的流入，并將糖酵解上限反應速率固定為4.9 mmol/g/h，意味著1,6-二磷酸果糖以恒定速率合成從而用于甘油合成或者生物物質合成。構建三個不同的模型（基本模型、Δcra模型、2xcra模型）進行分析，分析結果顯示2xcra模型最優，可獲得高甘油通量。因此，模型分析認為將Cra調控不同酶活性可能會使甘油合成率增加。
Cra調控下的pBAD啟動子促進甘油合成的理論和實驗分析
4. Cra調控的pBAD啟動子可改善生長速率和甘油合成
研究中發現Cra可抑制pBAD-Cra啟動子，為證明pBAD-Cra啟動子功能，檢測野生型和Δcra菌株中pBAD啟動子和pBAD-Cra啟動子活性。結果發現，野生型菌株中，pBAD-Cra啟動子活性低于pBAD啟動子，說明Cra對啟動子有抑制作用。而在Δcra菌株中，pBAD-Cra啟動子的活性略高于pBAD啟動子。這些結果表明Cra抑制pBAD-Cra啟動子，而這種調控作用在沒有Cra存在的情況下不發揮作用。因此，pBAD-Cra的低活性并不僅僅是因為序列改變，而是由于Cra主動抑制。
Cra對pBAD啟動子的調控作用
5. 高甘油通量下Cra調控pBAD啟動子維持高1,6-二磷酸果糖水平
為了深入探討Cra調控的動態規律，作者考察了甘油通路誘導下代謝組和蛋白質組的變化情況。如圖5所示，pBAD-Cra菌株可以在較高的甘油合成速率下維持較高的1,6-二磷酸果糖水平。這表明1,6-二磷酸果糖和Cra之間的相互作用抵消了1,6-二磷酸果糖的下降趨勢。其一，如果1,6-二酸果糖水平低于臨界值則Cra活性增加；其二，過高的Cra活性會抑制pBAD-Cra啟動子活性并抑制GPD1表達；其三，GDP1過低表達將恢復1,6-二磷酸果糖最初的濃度。因此，這種反饋調節機制不僅使1,6-二磷酸果糖維持在較高水平，提高甘油合成速率，而且能阻止大腸桿菌從糖酵解到糖異生的代謝轉變。
甘油通路誘導的代謝物和蛋白質含量變化情況
6. Cra調控促進類胡蘿卜素過表達型大腸桿菌的生長
由于很多生物物質合成以糖降解代謝物為前體，為考察該調控機制的普適性，作者利用pBAD啟動子來調控類胡蘿卜素合成與代謝途徑（如圖6所示）。類胡蘿卜素生物合成從糖酵解代謝產物丙酮酸和3-磷酸甘油醛開始，通過大腸桿菌的甲基赤蘚醇磷酸化途徑轉化為法尼基焦磷酸，法尼基焦磷酸進一步轉化為類胡蘿卜素。甲基赤蘚醇磷酸途徑兩種酶(Dxs和Dxr)是從質粒中過度表達的兩種pBAD啟動子，分別稱為pController和pController-Cra。類胡蘿卜素途徑的其它酶(CrtE/B/I/Y/Z)由另一個質粒(p胡蘿卜素)利用擬南芥原生啟動子進行表達。結果顯示Cra調節的啟動子在合成類胡蘿卜素途徑高誘導水平下可以維持更高的生長速度，并且高誘導劑不影響細胞生長和生成速率。這表明，Cra調控的pBAD啟動子具有廣泛的普適性，通過糖酵解代謝物調控其他合成途徑成為可能。
Cra調控的pBAD啟動子可促進類胡蘿卜素的大量合成
總結
本研究中，作者使用阿拉伯糖誘導的pBAD啟動子來調控大腸桿菌的合成代謝途徑。雖然在GFP表達的情況下，pBAD啟動子顯示出誘導劑濃度和表達率之間具有線性關系，但沒有觀察到甘油過量產生。在該情況下，誘導劑少量增加就可造成巨大的生長負擔且合成效率降低，最終導致包括甘油在內的各生物活性成分濃度降低。研究者通過代謝組學和蛋白質組學來探討了Cra對pBAD啟動子調控及宿主代謝水平的影響。從生物技術前景來看，該方法將有助于改良菌株合成技術，使其能夠有效應對工業規模生物反應器等外部干擾和基因表達等內部干擾。
參考文獻
Chun-Ying Wang, et al. Metabolome and proteome analyses reveal transcriptional misregulation in glycolysis of engineered E. coli. Nature Communications . 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25142-0.
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