C8-D1A小鼠腦星形細胞要怎么培養(yǎng)？實驗具體操作步驟是什么？要注意什么？

發(fā)布時間：

2022-01-21

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將小鼠處死后浸泡入體積分?jǐn)?shù)75% 乙醇中消毒，以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦（剔除海馬部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表層血絲，至腦組織呈乳白色

　　正常C8-D1A小鼠腦星形細胞培養(yǎng)
　　一、實驗試劑
　　1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
　　2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
　　3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
　　4、染色液： 0.4% Trypan Blue
　　5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
　　6、檢測試劑：抗小鼠CD 11b/c抗體，熒光標(biāo)記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
　　二、實驗器械
　　1、培養(yǎng)皿
　　2、培養(yǎng)瓶
　　3、直剪和眼科剪
　　4、眼科鑷和止血鉗
　　5、10ml注射器
　　6、玻璃滴管
　　7、燒杯
　　8、15ml離心管
　　三、實驗流程
　　取材
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　　去除大腦腦膜及血管,剔除海馬部分
　　↓
　　1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表層血絲
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　　先用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，用眼科剪反復(fù)剪10min，再用移液器輕輕吹打20~30次。
　　↓
　　將組織轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，加入消化液（PriCells）
　　↓
　　將離心管放置到37℃，15-20min水浴恒溫消化
　　↓
　　加入消化終止液（PriCells）終止反應(yīng)
　　↓
　　離心，1000rmp,10min，棄去上清
　　↓
　　重懸，計數(shù)細胞
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　　接種密度以1 × 106 個/ml
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　　培養(yǎng)37℃，5%CO2
　　四、實驗操作
　　1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
　　2、取材：正常昆明小鼠（生后24h內(nèi)）。
　　3、材料預(yù)處理：將小鼠處死后浸泡入體積分?jǐn)?shù)75% 乙醇中消毒，以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦（剔除海馬部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表層血絲，至腦組織呈乳白色。
　　4、消化液：用眼科鑷將組織撕碎成糜狀，再用眼科剪反復(fù)剪10min，最后再用移液槍輕輕吹打20~30次，將剪碎的組織用槍轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，37℃水浴消化15min。
　　5、終止消化：按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)。
　　6、收集重懸細胞：1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。
　　7、培養(yǎng)細胞密度：調(diào)整細胞密度以1 × 106 個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
　　8、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中。
　　五、細胞鑒定
　　1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細胞呈星形狀，細胞密度增高后呈現(xiàn)鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點。細胞具備良好的透光性。
　　2、免疫組織化學(xué)鑒定：利用OX-42 （CD 11b/c）免疫熒光染色。
　　3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細胞為3×104 個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。
　　4、細胞固定：用PBS洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
　　5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
　　6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
　　7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體，37℃孵育30min。
　　洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
　　8、封片：封片劑封片。
　　9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，膠質(zhì)細胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強黃綠色熒光，細胞核周圍尤其明顯。
　　六、注意事項
　　1、選材注意選取新生昆明小鼠（24h內(nèi)）。取材過程盡可能保證無菌，盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。
　　2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細胞及某些血清成分對膠質(zhì)細胞貼壁的影響。
　　3、膠質(zhì)細胞分離損傷嚴(yán)重影響膠質(zhì)細胞的生長，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
　　4、嚴(yán)格控制膠質(zhì)細胞培養(yǎng)條件。包括細胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
　　5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。實驗中，可以酌情考慮是否包被。
　　6、傳代培養(yǎng)細胞接種量為1×106 個（25 cm2 培養(yǎng)瓶），細胞倍增時間為36小時。細胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代，傳代次數(shù)增加，細胞體積增大，細胞之間間隙增加，細胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。