CHO細(xì)胞即中國倉鼠卵巢細(xì)胞無血清培養(yǎng)試驗(yàn)步驟及材料詳細(xì)操作過程分享
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2022-01-25
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1、CHO細(xì)胞
CHO細(xì)胞即中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary)，該細(xì)胞具有不死性，可以傳代百代以上，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞。全世界批準(zhǔn)正式應(yīng)用于人類疾病治療或疾病預(yù)防的基因工程產(chǎn)品約有三十多種，其中只有一種(乙肝疫苗)是由酵母菌生產(chǎn)的，其余所有產(chǎn)品都是由CHO細(xì)胞和大腸桿菌生產(chǎn)的，大腸桿菌不能形成有活性的二聚體(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO卻具有如上的功能，因此CHO成為表達(dá)復(fù)雜生物大分子的理想宿主。另外CH0細(xì)胞在基因工程使用中還有一個優(yōu)點(diǎn)，該細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(fibroblast)，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌CHO內(nèi)源蛋白，因此對目標(biāo)蛋白分離純化工作十分有利。
2、CHO細(xì)胞血清培養(yǎng)
傳統(tǒng)上CHO細(xì)胞的培養(yǎng)都是在DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5~10的小牛血清(用于重組蛋白)或胎牛血清(用于雜交瘤生產(chǎn))單抗來完成的，血清除了供給細(xì)胞的營養(yǎng)成分外，還能促進(jìn)細(xì)胞開始合成DNA，對細(xì)胞的增殖有很大的作用。
實(shí)驗(yàn)證明，血清在細(xì)胞的體外培養(yǎng)中提供了細(xì)胞增殖所必需的生長因子。但哺乳動物的血清價(jià)格昂貴，成本高不適于今天的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而且哺乳動物血清作為補(bǔ)加物，存在許多問題，首先血清的來源存在問題，血清來源于特定的地區(qū)，因而如果該地區(qū)發(fā)生災(zāi)荒或牛群中流行疾病，都可導(dǎo)致血清失去供應(yīng)源。血清批量之間的差異大，重復(fù)性差，由于血清來源于動物，動物個體或群體的差異及時(shí)間上的差異都能導(dǎo)致每個批號的血清不完全一樣。
從重組蛋白生產(chǎn)的角度來看，出于Q和Qc的要求，每換一個批號的血清，都包含大量的驗(yàn)證工作，這就給生產(chǎn)帶來很大的麻煩。另外血清來源于動物因此經(jīng)常被污染，污染的血清往往導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，蛋白產(chǎn)量下降，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前購自各大公司的血清雖能消滅細(xì)菌和所有支原體，但很難保證除去所有的病毒污染。
血清的成分十分復(fù)雜，經(jīng)研究表明，血清除含有促進(jìn)生長的活性成分外，還含有一定的細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制物質(zhì)，對細(xì)胞有去分化作用，影響細(xì)胞功能的表達(dá) 血清復(fù)雜的成分也給基因工程表達(dá)產(chǎn)物的下游工作帶來很大的困難，因此成分明確，價(jià)格經(jīng)濟(jì)的無血清培養(yǎng)基成為CHO細(xì)胞培養(yǎng)的一種必然需求。
3、CHO細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
從血清培養(yǎng)所面臨的問題，我們不難看出：人們急切地需要找到能夠替代血清的物質(zhì)，從而解決血清培養(yǎng)所面臨的這一問題。五十年代起，科學(xué)家就開始研究無血清培養(yǎng)基。要發(fā)展無血清培養(yǎng)基，必須找到適當(dāng)?shù)木哂醒骞δ艿囊蜃樱捎谘宓某煞植磺宥沂謴?fù)雜，具有多種促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖的因子，因此要找到血清替代物是相當(dāng)困難的。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)單獨(dú)或一起使用可以替代血清。這些物質(zhì)分別是微量元素、生長因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制劑。微量元素是細(xì)胞代謝所必需的，是無血清培養(yǎng)基的主要添加物之一，鐵、鋅、硒等都是不可缺少的，有些資料證明還需要銅、錳、鉬、釩等元素，這些元素在血清培養(yǎng)中由血清提供，在無血清培養(yǎng)中需要補(bǔ)加。促生長因子是無血清培養(yǎng)基的主要補(bǔ)加物之一。
現(xiàn)在研究者已經(jīng)從血清、各種組織和生物成分中用生物工程的方法，制取了各種促細(xì)胞生長物，如表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板生長因子(PDGF)、生長調(diào)節(jié)素(SM)等。現(xiàn)已證明很多激素具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，無血清培養(yǎng)基缺乏對細(xì)胞的保護(hù)，血清培養(yǎng)殘余的胰蛋白酶對血清的損傷十分嚴(yán)重，因而無血清培養(yǎng)基必須添加酶抑制劑。脂類是細(xì)胞膜的主要成分，添加脂類可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，隨著無血清培養(yǎng)基研究的進(jìn)一步深入，無血清培養(yǎng)基將越來越完善。
無血清培養(yǎng)試驗(yàn)步驟
1、實(shí)驗(yàn)材料
CHO細(xì)胞株購于俄羅斯Soym Agromed，無血清培養(yǎng)基(CHO-S-sFM1I)購于Gibeo公司。
2、實(shí)驗(yàn)方法
（1）無血清培養(yǎng)基的配制
用90ml純水溶解制備1升量的袋裝Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1N NaOH將pH調(diào)為8.0，再用1N HC1調(diào)回至pH7.1，定容后用0.22μm濾器過濾除菌。
（2）CHO細(xì)胞的適應(yīng)
用含血清的常規(guī)培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基1:1(v/v)懸浮細(xì)胞，接種量為3×105個/ml。在37℃，8％培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞密度達(dá)5×105個/m1。然后用等體積的CHO-S-sFM1I 將細(xì)胞稀釋到3x 105個/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述操作，直至血清濃度降為0.1％后，用完全無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)到3×106個/ml。再以3×l05個/ml接種，傳50代，至此完成適應(yīng)工作。
（3）細(xì)胞計(jì)數(shù)參閱《組織培養(yǎng)技術(shù)4》的方法，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
（4）CHO細(xì)胞表達(dá)EPO水平應(yīng)用MIT比色法測定。
4、無血清培養(yǎng)基的發(fā)展
目前的無血清培養(yǎng)基已進(jìn)入第三代，第一代無血清培養(yǎng)基雖然不含有血清，但含有大量的動物或植物蛋白，如BSA或激素等，雖然它所含的總體蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，九十年代初，研究人員開發(fā)出了第二代無血清培養(yǎng)基，它完全不用動物來源的蛋白，如 LTI公司生產(chǎn)的 CH0～S—SFM I，它采用懸浮的CHO表達(dá)蛋白，培養(yǎng)基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重組蛋白的純化簡單，目前市售的無血清培養(yǎng)基主要是這一類。第三代無血清培養(yǎng)基現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)，它完全不含有蛋白或含量極低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培養(yǎng)基不含任何蛋白質(zhì)，沒有任何動物、人類蛋白或多肽，為表達(dá)產(chǎn)品的下游處理工作提供極大方便。
目前無血清培養(yǎng)基的價(jià)格還很高，不亞于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，因此降低無血清培養(yǎng)基的成本，開發(fā)出無血清、無蛋白、低成本的無血清培 養(yǎng)基日益受到人們的重視。隨著生物工程產(chǎn)品的開發(fā)和推廣，它的應(yīng)用愈來愈廣泛，相信在將來的生物制藥行業(yè)它將具有廣闊的市場前景和應(yīng)用空間。
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