CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞無血清培養試驗步驟及材料詳細操作過程分享
發布時間：
2022-01-25
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1、CHO細胞
CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary)，該細胞具有不死性，可以傳代百代以上，是目前生物工程上廣泛使用的細胞。全世界批準正式應用于人類疾病治療或疾病預防的基因工程產品約有三十多種，其中只有一種(乙肝疫苗)是由酵母菌生產的，其余所有產品都是由CHO細胞和大腸桿菌生產的，大腸桿菌不能形成有活性的二聚體(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO卻具有如上的功能，因此CHO成為表達復雜生物大分子的理想宿主。另外CH0細胞在基因工程使用中還有一個優點，該細胞屬于成纖維細胞(fibroblast)，是一種非分泌型細胞，它本身很少分泌CHO內源蛋白，因此對目標蛋白分離純化工作十分有利。
2、CHO細胞血清培養
傳統上CHO細胞的培養都是在DMEM／F12基礎培養基中添加5~10的小牛血清(用于重組蛋白)或胎牛血清(用于雜交瘤生產)單抗來完成的，血清除了供給細胞的營養成分外，還能促進細胞開始合成DNA，對細胞的增殖有很大的作用。
實驗證明，血清在細胞的體外培養中提供了細胞增殖所必需的生長因子。但哺乳動物的血清價格昂貴，成本高不適于今天的大規模工業化生產。而且哺乳動物血清作為補加物，存在許多問題，首先血清的來源存在問題，血清來源于特定的地區，因而如果該地區發生災荒或牛群中流行疾病，都可導致血清失去供應源。血清批量之間的差異大，重復性差，由于血清來源于動物，動物個體或群體的差異及時間上的差異都能導致每個批號的血清不完全一樣。
從重組蛋白生產的角度來看，出于Q和Qc的要求，每換一個批號的血清，都包含大量的驗證工作，這就給生產帶來很大的麻煩。另外血清來源于動物因此經常被污染，污染的血清往往導致細胞生長緩慢，蛋白產量下降，甚至導致細胞死亡。目前購自各大公司的血清雖能消滅細菌和所有支原體，但很難保證除去所有的病毒污染。
血清的成分十分復雜，經研究表明，血清除含有促進生長的活性成分外，還含有一定的細胞毒性物質和抑制物質，對細胞有去分化作用，影響細胞功能的表達 血清復雜的成分也給基因工程表達產物的下游工作帶來很大的困難，因此成分明確，價格經濟的無血清培養基成為CHO細胞培養的一種必然需求。
3、CHO細胞的無血清培養基
從血清培養所面臨的問題，我們不難看出：人們急切地需要找到能夠替代血清的物質，從而解決血清培養所面臨的這一問題。五十年代起，科學家就開始研究無血清培養基。要發展無血清培養基，必須找到適當的具有血清功能的因子，由于血清的成分不清而且十分復雜，具有多種促進細胞生長和增殖的因子，因此要找到血清替代物是相當困難的。
人們已經發現一些物質單獨或一起使用可以替代血清。這些物質分別是微量元素、生長因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制劑。微量元素是細胞代謝所必需的，是無血清培養基的主要添加物之一，鐵、鋅、硒等都是不可缺少的，有些資料證明還需要銅、錳、鉬、釩等元素，這些元素在血清培養中由血清提供，在無血清培養中需要補加。促生長因子是無血清培養基的主要補加物之一。
現在研究者已經從血清、各種組織和生物成分中用生物工程的方法，制取了各種促細胞生長物，如表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板生長因子(PDGF)、生長調節素(SM)等。現已證明很多激素具有促進細胞生長的作用，胰島素能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸，無血清培養基缺乏對細胞的保護，血清培養殘余的胰蛋白酶對血清的損傷十分嚴重，因而無血清培養基必須添加酶抑制劑。脂類是細胞膜的主要成分，添加脂類可以促進細胞增殖，隨著無血清培養基研究的進一步深入，無血清培養基將越來越完善。
無血清培養試驗步驟
1、實驗材料
CHO細胞株購于俄羅斯Soym Agromed，無血清培養基(CHO-S-sFM1I)購于Gibeo公司。
2、實驗方法
（1）無血清培養基的配制
用90ml純水溶解制備1升量的袋裝Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1N NaOH將pH調為8.0，再用1N HC1調回至pH7.1，定容后用0.22μm濾器過濾除菌。
（2）CHO細胞的適應
用含血清的常規培養基和無血清培養基1:1(v/v)懸浮細胞，接種量為3×105個/ml。在37℃，8％培養箱中培養，使細胞密度達5×105個/m1。然后用等體積的CHO-S-sFM1I 將細胞稀釋到3x 105個/ml，繼續培養，重復上述操作，直至血清濃度降為0.1％后，用完全無血清培養基培養到3×106個/ml。再以3×l05個/ml接種，傳50代，至此完成適應工作。
（3）細胞計數參閱《組織培養技術4》的方法，用血球計數板計數。
（4）CHO細胞表達EPO水平應用MIT比色法測定。
4、無血清培養基的發展
目前的無血清培養基已進入第三代，第一代無血清培養基雖然不含有血清，但含有大量的動物或植物蛋白，如BSA或激素等，雖然它所含的總體蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，九十年代初，研究人員開發出了第二代無血清培養基，它完全不用動物來源的蛋白，如 LTI公司生產的 CH0～S—SFM I，它采用懸浮的CHO表達蛋白，培養基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重組蛋白的純化簡單，目前市售的無血清培養基主要是這一類。第三代無血清培養基現在已經出現，它完全不含有蛋白或含量極低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培養基不含任何蛋白質，沒有任何動物、人類蛋白或多肽，為表達產品的下游處理工作提供極大方便。
目前無血清培養基的價格還很高，不亞于大規模的工業化生產，因此降低無血清培養基的成本，開發出無血清、無蛋白、低成本的無血清培 養基日益受到人們的重視。隨著生物工程產品的開發和推廣，它的應用愈來愈廣泛，相信在將來的生物制藥行業它將具有廣闊的市場前景和應用空間。
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