正常人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟及實(shí)驗(yàn)的具體方法分享

發(fā)布時(shí)間：

2022-02-17

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將供體角膜放于消毒過的容器上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成12個(gè)三角形組織片。應(yīng)一刀切下，避免鋸割。如此仔細(xì)處理角膜可減少對(duì)膠原基質(zhì)的破壞和成纖維細(xì)胞的脫落

　　1. 正常人角膜移植供體角膜（推薦閱讀：HCECs人角膜上皮細(xì)胞）
　　2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA
　　3. KGM：無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，添加0.15mmol/L 鈣、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5mg/ml 胰島素、0.5mg/ml 氫化可的松和30mg/ml 牛垂體提取物；MEM；PBSA；胎牛血清
　　4. FNC：10mg/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和100mg/ml BSA（bovine serum albumin）。BSA作為穩(wěn)定劑
　　5. 6孔培養(yǎng)板：用鼠尾Ⅰ型膠原蛋白涂培養(yǎng)板底壁
　　6. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4
　　7. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷
　　8. 離心管（15ml、50ml）
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1. 將供體角膜放于消毒過的容器上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成12個(gè)三角形組織片。應(yīng)一刀切下，避免鋸割。如此仔細(xì)處理角膜可減少對(duì)膠原基質(zhì)的破壞和成纖維細(xì)胞的脫落。
　　2. 將角膜組織片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型膠原蛋白預(yù)處理的6孔培養(yǎng)板，每孔放4個(gè)組織塊。
　　3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養(yǎng)皿表面充分接觸。將組織片放置20min，使其變干。
　　4. 將一滴KGM輕輕滴于組織片上，在37℃和5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用抗菌素的培養(yǎng)液保存的，但全部操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。
　　5. 第2d，在培養(yǎng)皿中加入1ml培養(yǎng)液。在培養(yǎng)早期，可觀察到細(xì)胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細(xì)胞從角膜或虹膜遷出。無血清培養(yǎng)液含有低濃度鈣離子（0.15mmol/L），減少膠原基質(zhì)降解，故這種培養(yǎng)液可減少成纖維細(xì)胞長出。
　　6. 在植入角膜組織片后第5d，用鑷子將組織片取出，再加入3ml培養(yǎng)液。取出組織片后，貼壁細(xì)胞繼續(xù)增值。第2周，細(xì)胞生長形成單層，呈現(xiàn)上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個(gè)角膜約獲得6×106 個(gè)上皮細(xì)胞。每周換液2次。
　　7. 擴(kuò)增培養(yǎng)：取出組織片后，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%-80%時(shí)，用PBS浸洗細(xì)胞。然后，在37℃條件下用胰蛋白酶-EDTA液處理4min。用含有10%FBS的PBS終止消化。將細(xì)胞離心后，用KGM混懸。計(jì)數(shù)細(xì)胞，以1×104個(gè)/cm2密度將細(xì)胞接種于涂有FNC的培養(yǎng)皿。在37℃、5%CO2 條件下培養(yǎng)。1d后換培養(yǎng)液。