BMSCs在視網(wǎng)膜脫離動(dòng)物模型體內(nèi)及低氧培養(yǎng)的661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中所發(fā)揮的保護(hù)作用及其機(jī)制
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2022-03-29
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661W小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞感光細(xì)胞損傷可發(fā)生于視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜光損傷、眼外傷等疾病中，其不可逆性損傷可導(dǎo)致視功能的嚴(yán)重受損，甚至導(dǎo)致盲的發(fā)生。其中視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment, RD)是最常見的嚴(yán)重威脅視力的疾病之一，發(fā)生于視網(wǎng)膜全層裂孔、玻璃體視網(wǎng)膜牽拉或者視網(wǎng)膜下滲出等情況而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮的分離，從而導(dǎo)致光感受器細(xì)胞失去代謝和營(yíng)養(yǎng)支持而發(fā)生損傷。由于視網(wǎng)膜脫離過(guò)程中涉及到的光感受器細(xì)胞死亡受到多種信號(hào)途徑相互作用影響，同時(shí)伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生、視網(wǎng)膜三級(jí)神經(jīng)元激活及重塑等過(guò)程，因此單一針對(duì)某條通路展開治療不能達(dá)到完全控制細(xì)胞凋亡并保持視網(wǎng)膜完整性的目的。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在眼科多種疾病治療中己開展了廣泛的研究，如角膜緣干細(xì)胞缺乏、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、缺血及視神經(jīng)損傷等，己被證實(shí)具有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的潛能，同時(shí)能夠表達(dá)多種細(xì)胞因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，同時(shí)抑制局部炎癥反應(yīng)改善視網(wǎng)膜微環(huán)境，減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡;修復(fù)RPE細(xì)胞，保護(hù)視網(wǎng)膜外屏障，并可能活化視網(wǎng)膜干細(xì)胞。
因此，本研究擬探討B(tài)MSCs在視網(wǎng)膜脫離動(dòng)物模型體內(nèi)及低氧培養(yǎng)的視錐細(xì)胞系661w細(xì)胞中所發(fā)揮的保護(hù)作用及其機(jī)制。
方法
1.體外實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MSCs對(duì)661w細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制
(1)利用低氧培養(yǎng)法制備細(xì)胞損傷模型，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)低氧不同時(shí)長(zhǎng)后細(xì)胞活力改變，同時(shí)利用AnnexinV-PI法、線粒體膜電位檢測(cè)及caspase-3表達(dá)等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，利用Western blot、酸性囊泡標(biāo)記物觀察低氧后細(xì)胞自噬情況;同時(shí)低氧處理前1h加入自噬抑制劑3_MA，觀察細(xì)胞活力、凋亡及自噬的變化;
(2)利用transwell培養(yǎng)體系將損傷的661w細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)，同樣方法檢測(cè)細(xì)胞活力、凋亡情況及自噬情況改變。
2.體內(nèi)研究分析BMSCs視網(wǎng)膜保護(hù)作用及機(jī)制
(1)分離獲得BMSCs原代培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定;
(2)制備視網(wǎng)膜脫離大鼠模型，將培養(yǎng)的BMSCs移植入視網(wǎng)膜下，觀察移植后視網(wǎng)膜復(fù)位時(shí)間段內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜及BMSCs情況;以造模后未進(jìn)行處理組及視網(wǎng)膜下注射PBS組為對(duì)照進(jìn)行比較;
(3)初步檢測(cè)BMSCs對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用效果:組織切片及HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)及外核層厚度，免疫熒光法及Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞標(biāo)記物Rhodopsin表達(dá)情況;
(4)研究BMSCs對(duì)視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制:利用TUNEL法計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況;Westernblot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量;
(5 ) BMSCs在眼內(nèi)情況:利用細(xì)胞標(biāo)記試劑盒標(biāo)記BMSCs后移植到RD模型視網(wǎng)膜下，免疫熒光法檢測(cè)移植后的BMSCs在眼內(nèi)移行及分化情況。
結(jié)果
1. 661w細(xì)胞低氧培養(yǎng)2h, 4h, 8h, 16h, 24h及48h后，細(xì)胞活力發(fā)生不同程度的降低，伴有細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡數(shù)量增加及細(xì)胞形態(tài)異常，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬在低氧后開始增加，低氧8h時(shí)達(dá)到高峰后降低，利用3-MA抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞活力下降;
2.與BMSCs共培養(yǎng)的661w細(xì)胞形態(tài)較為正常，且活力有所增加，凋亡細(xì)胞明顯減少，而共培養(yǎng)時(shí)加入自噬抑制劑，即使與BMSCs共培養(yǎng)，細(xì)胞活力仍發(fā)生降低的同時(shí)凋亡細(xì)胞增多;
3.移植BMSCs的視網(wǎng)膜脫離眼中，視網(wǎng)膜外核層厚度更接近正常視網(wǎng)膜，與空白組及對(duì)照相相比光感受器細(xì)胞較厚及排列較為規(guī)整;
4.移植BMSCs后，早期視網(wǎng)膜外核層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而且Caspase-3,8,9的表達(dá)量均較對(duì)照減少;
5.移植BMSCs后的短期內(nèi)，視網(wǎng)膜LC-3II表達(dá)升高、P62表達(dá)降低，視網(wǎng)膜內(nèi)自噬激活;
6.移植干細(xì)胞眼內(nèi)沒有觀察到視網(wǎng)膜下移植的BMSCs有明顯的移行整合過(guò)程及向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的傾向。
結(jié)論
本研究以BMSCs為研究對(duì)象，選擇視網(wǎng)膜脫離及細(xì)胞低氧培養(yǎng)作為體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探索干?xì)胞在其中發(fā)揮的保護(hù)作用及可能的部分機(jī)制。結(jié)果提示低氧環(huán)境對(duì)體外培養(yǎng)的光感受器細(xì)胞系661w細(xì)胞造成損傷，而早期自噬水平的提高有利于幫助細(xì)胞度過(guò)低氧應(yīng)激，降低細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞活力;與BMSCs共培養(yǎng)能夠降低低氧對(duì)661w的損傷，減少細(xì)胞凋亡，這種保護(hù)作用的發(fā)揮在一定程度上是由BMSCs介導(dǎo)的自噬調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜細(xì)胞特別是光感受器細(xì)胞發(fā)生了包括凋亡、自噬、壞死、增殖等一系列病理變化，致使視網(wǎng)膜復(fù)位后仍存在光感受器細(xì)胞形態(tài)功能不能完全恢復(fù);BMSCs眼內(nèi)移植后能夠明顯減少光感受器細(xì)胞死亡，保存視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，其能夠減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，并在移植后短期內(nèi)激活視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬，幫助視網(wǎng)膜細(xì)胞度過(guò)視網(wǎng)膜脫離后的缺氧及低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)期。
本實(shí)驗(yàn)觀察BMSCs在光感受器細(xì)胞損傷時(shí)發(fā)揮的保護(hù)作用的同時(shí)研究其發(fā)揮作用的機(jī)制，一方面可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減少細(xì)胞損失，另一方面可以激活細(xì)胞自噬從使細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)中存活。
關(guān)鍵詞:
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，光感受器細(xì)胞損傷，視網(wǎng)膜脫離，低氧，凋亡，自噬
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