高糖介導的人主動脈平滑肌紐胞（HASMCs）功能改變在動脈粥樣硬化中的作用及分子機制
發布時間：
2022-04-01
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研究背景
隨著人們飲禽結構的改變和肥粹率的增加，糖尿?。╠iabetes，DM）的發病率日益端高。流行病學調查顯示，糖尿病患者中動脈粥樣硬化（mheroselerosis，AS〕的發生率和嚴重性選高于非糖尿病患者，而AS是冠心病等心血管疾病的主要病理基動，故深入研究精尿病加速AS 發生發展的具體機制，尋找有效的預防和治療方法至關重要。（推薦閱讀：HCASMC人冠狀動脈平滑肌細胞）
正常血管壁中的平滑肌婦圖（vasculur smoothmescle cells，VSMCs）只存在于均脈中限中，以收縫型為主，其增殖速度很慢。糖尿病狀態下，高糖、活性氧等刺激損傷直管內皮。內度細胞、炎性組教和血小極等釋放大慧生長因子和趨化因予，使 VSMCs 從生長羽制中御以釋放∶同時上述細胞還能分泌大量基質金屬蛋白酵（matrlx eetllogcoteinae，MPs》，后者催化組家外基質（extracellular marix，ECM）降解，促使 VSMCs從中膜遷移至內膜，遷移到內腹層的VSMCs可分滯多種粘附分子和趨化因子。促使單核巨啉細胞浸稅和泡沫煙粗約形或。區面。VSMCs 增殖和遷移是糖尿病 AS斑塊形成的中心環節。
組圖周期作為增殖信號級聯反應的題終途徑。技各種有絲分裂刺激所共享。堆膿周期分為有絲分裂間期（G1 期、S期和 GZ期）和有絲分裂期（M期》，其中的各個檢查點均有相應的報數周期蛋白（cyei）、潤胞周期蛋白依糧性激酶（eyelin如opendent enes，CDK）及其為制劑（CDK inhibltot，cDK1）對其進行調控。直管損傷后，VSMCs響應有絲分裂原別藻從G1 期進入S期;其中oglinDI-GCDK4 和 cyeliE-CDK2 在這一特接期間按序發揮作用，是這一時期的細胞周期進穿所必需的，許多藥劑，包括抗 VSMCs增殖劑，以及抗血栓和抗血小板劑?？梢愿淖兗毟怪芷谥械囊粋€或多個調節事件，導致紙數周期進程的阻斷，從面抱制紐胞增殖。
多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly（ADP-ibos）polymerase，PARP）-1是 PARP 家練最主要的亞型.發并了90%的PARP活性，PARP-1通過值化白身和其他染色質相關蛋白的多聚二磷酸腺苷核糖（poly（ADP-ibosyl》atiom，PARyktion）化來修復DNA，此外;PARP-1涉及多種組圖功能，包括基因轉錄調控，須胞原期進展、長往。能量代側和細略遷移，精尿病狀態下，氧化應激、更硝假站等損傷DNA，PARP-1能夠識別DNA 單鏈或雙鏈損傷并枝激話。先前一系列研究已證實 PARP-1在糖尿病心機病，腎病，視網膜病及神經系統損害中的重要作用，然前其在燥展病加速1管內增生中的作用為未耀明。
研究目的
1.觀察高模制激對人主動脈平滑從紐胞（HASMCs）中PARP-1表達的影響∶
2.哥究PARP-1在高糖誘導的 HASMCs增殖和遷移中的作用;
3.研究 PARP-1在鏡尿病血管內腺增生中的作用。
研究方法
1.HASMCs的培養及分姐
用含2%FBS的SMCM培養基對 HASMCs進行體外培養，置于s%CO2，37C 孵育箱。
分組一∶根據高糖不同喇濰時間選行分組∶0小時、24小時、72小時、5天;分租二，正常對阻坦（NC，5.5 mM葡萄糖）、高滲對圍組 （0c，5.5 mM荒藥糖-275 mM甘露醇》、高糖利意跟（HG，33 mM葡藥精）、高糖+PARP-1 抑制劑組（HG+PJ34。3mM葡萄糖-5回MPJ34>∶刻滋 72小時后收集細胞和培養基。
2.HASMC 增殖檢測
用Cell-LirEdU 方法檢測組愿的增殖情況。
3.渣式迎屋術拾測
收集于預后的組腳，穩化丙啶（propldiumiodide，PI）染色，利用液式細愿父檢測集教而期的變化。
4.HASMC。 遷移檢測用Transwell 小室法構測紙家的遷移情況，
5. 明咬酶謝檢測
用明膠酶蓋法檢測各組HASMC。上清浪中 MMP2和 MMP9約活性。
6.蛋白質印漆法《wtem Rm）
視取不同千預組HASMCs粉緊白，采用 Westem 圍ot方檢測PARP1、PAR、MMP2、MMP9及PCNA在蛋自水平的變化，以β-actin為內參照蛋白。
7.實驗動物模型構建和組識獲取
實驗動物對象為C57BL%小限和C57BL6PARP-1基因敲除小鼠，均為8閥齡、增性、體重約25 g.將10只CS7BL6小蒙和10只CS7BL/PARP-1+小鼠腹腔注射鏈原佐剝素（septozotscin。STZ），劑量為5-gkg，另外 10只C9w作小以飄酸注射等法織的檸檬酸屋援沖液作為對州組。連續注射針s天。2 題后始測隨機血精值，大于 16.7 mmol為1 型糖尿病造模成功，最終實驗動特分沮如下;正管對圍組，糖尿病CS7B16小屬組、糖菜病 PARP-1小服近。遺模成功后，糖尿病和非糖尿病小鼠均行左側頸總動脈結扎干術。術后3周取村。剝離整根主跳活包抵左側硝總動警。放入5%名聚甲限中劃使。液水準洗后進行石縫包埋和切片。
8.人體直置姐識獲取和分組
與本隧移植中心合作，收集人體冠狀動腦各分支。查看患者資料。排除悉性腫宿、急性炎控性疾病與風濕等氧統狹病患者的組織。臨床直管標本獲取后，迅迫放入49%多聚甲醛中，固定24小時后濾水沖洗過夜。初取左冠找動醚同旋支遠段部分Smm段進行石的包坦稱間片。是微像下觀察，塑服庭管內費有于增生格組織分為正常組和增生組。
9.組織形態及免疫組織染色
對石短切片選行H&E到色，運圍學疫組織化手驗色法，粒測PARP-1.M0MP. MMP9 及增殖相胞核其原《proliferacing cell nuckear antign， PCNA）的表達水平，10.燒計學分析運用 SPSS v180軟件進行數據分析。所有數據用均數生標準誤 （MeansSEM）表示，采用Oneway ANOVA和Tuey post-hoc 方法進行分析，p值<0.05 時視為有統計學章義。
研究結果
1.高摘刺額促使 HASIMCs中 PARP-I 的表達增加
用高糖（33mM，HG）刺激HASMCs，Wesem Blot 檢測發殘 PARP-1 蛋白表達量于72小時達高峰。
2.高精潮意通過上調 PARP-1促進 HASMCz增殖
CcLightEdU 檢測結果發現，與NC 組和 OC 組相比，HG 刺激顯著提高了HASMC3對EdU韻攝取率;在HG環境下，加入PARP-1 抑制劑PJ4別很大程度的減低了EdU 攝取率。流式細激劑漸檢測發現，與NC 組和 OC 組相比，HG GL 期細胞數目明顯減少面S期圖數目明暴增加∶PJ4是著辯制了HG誘導的GI-S慧較換，Wsr Blot結果提示，相比于與NC組和0C組∶HG組中PARP-1 活性產物PAR和 GI-5期較換的重要標志物 PCNA表達均明顯上升，P4可是著抑制HG 誘導豹 PAR、PCNA 表達的增加。以上說明 HG 刺激可酒通過上調PARP-1的表達和活性，促進細胞 G1-S期轉換，進而促進HASMCs增殖。
3.高糖刺數通汶上調PARP-1促進HASMGs遷移
Trarswell 細胞遷移實驗結果表明，與 NC 姐和 OC 組相比。HG 組 HASMCs 的遷移顯著提高;HG+PJ34組相比于HG粗組胞遷移率明顯降低。Western Bkoat 和明膠酶譜檢測結果顯示，相比于 NC 組和 OC∶組。HG 組 MMP2 和 MMP9表達和活性是著提高;在HG環境下，加入PJ4可品著抑制MIMPs的表達和活性。
4.PARP-1促進糖尿病小藏在管內膜增生
1E 曼色結果呈示。與正常對照迅相比，精尿病Cs70L6小某預動脈內照用墨增厚∶糖尿病 PARP-!小家殖動脈內落及度相比于摘息病C57AL活小家明是菲寧。
免疫組化染色結果是示，與正常對阻坦相比，摘尿病 C57BL 小鼠頸動脈內膜明是增厚，其中 PARP-1、PCNA、MMP2和MIMP9的表達明顯箱加∶相比于糖尿病 C57RL師 公鼠，糖探病 PARP-產小服烈動練內膜中 PCNA。MMPp 和MMP的表達明盟孩氣，另務，我們用主動脈切片速行免燒組化警色，結要與硬動泳切片一致。
5.PARP-1在人招狀動綠內服增生中的作用
與正常對理組組比，著生組內牌中 PARP-1、PONA、MMP塑MMP9 的表達明尿增加，與小佩實驗結果一致。
研究結論
1.在高糖刺激下的 HASMCs和精壓病血管中，PARP-1的表達上調。
2.PRP!請過保進性到G1S期轉推;促進 HSMC1道看∶通過上請M0MP2. 9的表達和活性，促進 HASMSCs遷移。
3.糖城病今鼠體內。PARP-1上調可促進 VSMG增殖，丟移及內要埋厚。蔥險PARP-1可有效料制工管內要建生，
關鍵詞
PARP-1;鞭采病增殖∶遷移，內調滑生
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