高糖介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌紐胞（HASMCs）功能改變在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及分子機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-01

來源：

專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤色)

作者：

吉妮歐

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隨著人們飲禽結(jié)構(gòu)的改變和肥粹率的增加，糖尿病（diabetes，DM）的發(fā)病率日益端高。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中動(dòng)脈粥樣硬化（mheroselerosis，AS〕的發(fā)生率和嚴(yán)重性選高于非糖尿病患者，而AS是冠心病等心血管疾病的主要病理基動(dòng)，故深入研究精尿病加速AS 發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，尋找有效的預(yù)防和治療方法至關(guān)重要

　　研究背景
　　隨著人們飲禽結(jié)構(gòu)的改變和肥粹率的增加，糖尿病（diabetes，DM）的發(fā)病率日益端高。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中動(dòng)脈粥樣硬化（mheroselerosis，AS〕的發(fā)生率和嚴(yán)重性選高于非糖尿病患者，而AS是冠心病等心血管疾病的主要病理基動(dòng)，故深入研究精尿病加速AS 發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，尋找有效的預(yù)防和治療方法至關(guān)重要。（推薦閱讀：HCASMC人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞）
　　正常血管壁中的平滑肌婦圖（vasculur smoothmescle cells，VSMCs）只存在于均脈中限中，以收縫型為主，其增殖速度很慢。糖尿病狀態(tài)下，高糖、活性氧等刺激損傷直管內(nèi)皮。內(nèi)度細(xì)胞、炎性組教和血小極等釋放大慧生長因子和趨化因予，使 VSMCs 從生長羽制中御以釋放∶同時(shí)上述細(xì)胞還能分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酵（matrlx eetllogcoteinae，MPs》，后者催化組家外基質(zhì)（extracellular marix，ECM）降解，促使 VSMCs從中膜遷移至內(nèi)膜，遷移到內(nèi)腹層的VSMCs可分滯多種粘附分子和趨化因子。促使單核巨啉細(xì)胞浸稅和泡沫煙粗約形或。區(qū)面。VSMCs 增殖和遷移是糖尿病 AS斑塊形成的中心環(huán)節(jié)。
　　組圖周期作為增殖信號級聯(lián)反應(yīng)的題終途徑。技各種有絲分裂刺激所共享。堆膿周期分為有絲分裂間期（G1 期、S期和 GZ期）和有絲分裂期（M期》，其中的各個(gè)檢查點(diǎn)均有相應(yīng)的報(bào)數(shù)周期蛋白（cyei）、潤胞周期蛋白依糧性激酶（eyelin如opendent enes，CDK）及其為制劑（CDK inhibltot，cDK1）對其進(jìn)行調(diào)控。直管損傷后，VSMCs響應(yīng)有絲分裂原別藻從G1 期進(jìn)入S期;其中oglinDI-GCDK4 和 cyeliE-CDK2 在這一特接期間按序發(fā)揮作用，是這一時(shí)期的細(xì)胞周期進(jìn)穿所必需的，許多藥劑，包括抗 VSMCs增殖劑，以及抗血栓和抗血小板劑。可以改變細(xì)腹周期中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)事件，導(dǎo)致紙數(shù)周期進(jìn)程的阻斷，從面抱制紐胞增殖。
　　多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly（ADP-ibos）polymerase，PARP）-1是 PARP 家練最主要的亞型.發(fā)并了90%的PARP活性，PARP-1通過值化白身和其他染色質(zhì)相關(guān)蛋白的多聚二磷酸腺苷核糖（poly（ADP-ibosyl》atiom，PARyktion）化來修復(fù)DNA，此外;PARP-1涉及多種組圖功能，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，須胞原期進(jìn)展、長往。能量代側(cè)和細(xì)略遷移，精尿病狀態(tài)下，氧化應(yīng)激、更硝假站等損傷DNA，PARP-1能夠識(shí)別DNA 單鏈或雙鏈損傷并枝激話。先前一系列研究已證實(shí) PARP-1在糖尿病心機(jī)病，腎病，視網(wǎng)膜病及神經(jīng)系統(tǒng)損害中的重要作用，然前其在燥展病加速1管內(nèi)增生中的作用為未耀明。
　　研究目的
　　1.觀察高模制激對人主動(dòng)脈平滑從紐胞（HASMCs）中PARP-1表達(dá)的影響∶
　　2.哥究PARP-1在高糖誘導(dǎo)的 HASMCs增殖和遷移中的作用;
　　3.研究 PARP-1在鏡尿病血管內(nèi)腺增生中的作用。
　　研究方法
　　1.HASMCs的培養(yǎng)及分姐
　　用含2%FBS的SMCM培養(yǎng)基對 HASMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，置于s%CO2，37C 孵育箱。
　　分組一∶根據(jù)高糖不同喇濰時(shí)間選行分組∶0小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、5天;分租二，正常對阻坦（NC，5.5 mM葡萄糖）、高滲對圍組（0c，5.5 mM荒藥糖-275 mM甘露醇》、高糖利意跟（HG，33 mM葡藥精）、高糖+PARP-1 抑制劑組（HG+PJ34。3mM葡萄糖-5回MPJ34>∶刻滋 72小時(shí)后收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。
　　2.HASMC 增殖檢測
　　用Cell-LirEdU 方法檢測組愿的增殖情況。
　　3.渣式迎屋術(shù)拾測
　　收集于預(yù)后的組腳，穩(wěn)化丙啶（propldiumiodide，PI）染色，利用液式細(xì)愿父檢測集教而期的變化。
　　4.HASMC。遷移檢測用Transwell 小室法構(gòu)測紙家的遷移情況，
　　5. 明咬酶謝檢測
　　用明膠酶蓋法檢測各組HASMC。上清浪中 MMP2和 MMP9約活性。
　　6.蛋白質(zhì)印漆法《wtem Rm）
　　視取不同千預(yù)組HASMCs粉緊白，采用 Westem 圍ot方檢測PARP1、PAR、MMP2、MMP9及PCNA在蛋自水平的變化，以β-actin為內(nèi)參照蛋白。
　　7.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建和組識(shí)獲取
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對象為C57BL%小限和C57BL6PARP-1基因敲除小鼠，均為8閥齡、增性、體重約25 g.將10只CS7BL6小蒙和10只CS7BL/PARP-1+小鼠腹腔注射鏈原佐剝素（septozotscin。STZ），劑量為5-gkg，另外 10只C9w作小以飄酸注射等法織的檸檬酸屋援沖液作為對州組。連續(xù)注射針s天。2 題后始測隨機(jī)血精值，大于 16.7 mmol為1 型糖尿病造模成功，最終實(shí)驗(yàn)動(dòng)特分沮如下;正管對圍組，糖尿病CS7B16小屬組、糖菜病 PARP-1小服近。遺模成功后，糖尿病和非糖尿病小鼠均行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎干術(shù)。術(shù)后3周取村。剝離整根主跳活包抵左側(cè)硝總動(dòng)警。放入5%名聚甲限中劃使。液水準(zhǔn)洗后進(jìn)行石縫包埋和切片。
　　8.人體直置姐識(shí)獲取和分組
　　與本隧移植中心合作，收集人體冠狀動(dòng)腦各分支。查看患者資料。排除悉性腫宿、急性炎控性疾病與風(fēng)濕等氧統(tǒng)狹病患者的組織。臨床直管標(biāo)本獲取后，迅迫放入49%多聚甲醛中，固定24小時(shí)后濾水沖洗過夜。初取左冠找動(dòng)醚同旋支遠(yuǎn)段部分Smm段進(jìn)行石的包坦稱間片。是微像下觀察，塑服庭管內(nèi)費(fèi)有于增生格組織分為正常組和增生組。
　　9.組織形態(tài)及免疫組織染色
　　對石短切片選行H&E到色，運(yùn)圍學(xué)疫組織化手驗(yàn)色法，粒測PARP-1.M0MP. MMP9 及增殖相胞核其原《proliferacing cell nuckear antign， PCNA）的表達(dá)水平，10.燒計(jì)學(xué)分析運(yùn)用 SPSS v180軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)生標(biāo)準(zhǔn)誤（MeansSEM）表示，采用Oneway ANOVA和Tuey post-hoc 方法進(jìn)行分析，p值<0.05 時(shí)視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)章義。
　　研究結(jié)果
　　1.高摘刺額促使 HASIMCs中 PARP-I 的表達(dá)增加
　　用高糖（33mM，HG）刺激HASMCs，Wesem Blot 檢測發(fā)殘 PARP-1 蛋白表達(dá)量于72小時(shí)達(dá)高峰。
　　2.高精潮意通過上調(diào) PARP-1促進(jìn) HASMCz增殖
　　CcLightEdU 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組和 OC 組相比，HG 刺激顯著提高了HASMC3對EdU韻攝取率;在HG環(huán)境下，加入PARP-1 抑制劑PJ4別很大程度的減低了EdU 攝取率。流式細(xì)激劑漸檢測發(fā)現(xiàn)，與NC 組和 OC 組相比，HG GL 期細(xì)胞數(shù)目明顯減少面S期圖數(shù)目明暴增加∶PJ4是著辯制了HG誘導(dǎo)的GI-S慧較換，Wsr Blot結(jié)果提示，相比于與NC組和0C組∶HG組中PARP-1 活性產(chǎn)物PAR和 GI-5期較換的重要標(biāo)志物 PCNA表達(dá)均明顯上升，P4可是著抑制HG 誘導(dǎo)豹 PAR、PCNA 表達(dá)的增加。以上說明 HG 刺激可酒通過上調(diào)PARP-1的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞 G1-S期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)HASMCs增殖。
　　3.高糖刺數(shù)通汶上調(diào)PARP-1促進(jìn)HASMGs遷移
　　Trarswell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與 NC 姐和 OC 組相比。HG 組 HASMCs 的遷移顯著提高;HG+PJ34組相比于HG粗組胞遷移率明顯降低。Western Bkoat 和明膠酶譜檢測結(jié)果顯示，相比于 NC 組和 OC∶組。HG 組 MMP2 和 MMP9表達(dá)和活性是著提高;在HG環(huán)境下，加入PJ4可品著抑制MIMPs的表達(dá)和活性。
　　4.PARP-1促進(jìn)糖尿病小藏在管內(nèi)膜增生
　　1E 曼色結(jié)果呈示。與正常對照迅相比，精尿病Cs70L6小某預(yù)動(dòng)脈內(nèi)照用墨增厚∶糖尿病 PARP-!小家殖動(dòng)脈內(nèi)落及度相比于摘息病C57AL活小家明是菲寧。
　　免疫組化染色結(jié)果是示，與正常對阻坦相比，摘尿病 C57BL 小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜明是增厚，其中 PARP-1、PCNA、MMP2和MIMP9的表達(dá)明顯箱加∶相比于糖尿病 C57RL師公鼠，糖探病 PARP-產(chǎn)小服烈動(dòng)練內(nèi)膜中 PCNA。MMPp 和MMP的表達(dá)明盟孩氣，另務(wù)，我們用主動(dòng)脈切片速行免燒組化警色，結(jié)要與硬動(dòng)泳切片一致。
　　5.PARP-1在人招狀動(dòng)綠內(nèi)服增生中的作用
　　與正常對理組組比，著生組內(nèi)牌中 PARP-1、PONA、MMP塑MMP9 的表達(dá)明尿增加，與小佩實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　研究結(jié)論
　　1.在高糖刺激下的 HASMCs和精壓病血管中，PARP-1的表達(dá)上調(diào)。
　　2.PRP!請過保進(jìn)性到G1S期轉(zhuǎn)推;促進(jìn) HSMC1道看∶通過上請M0MP2. 9的表達(dá)和活性，促進(jìn) HASMSCs遷移。
　　3.糖城病今鼠體內(nèi)。PARP-1上調(diào)可促進(jìn) VSMG增殖，丟移及內(nèi)要埋厚。蔥險(xiǎn)PARP-1可有效料制工管內(nèi)要建生，
　　關(guān)鍵詞
　　PARP-1;鞭采病增殖∶遷移，內(nèi)調(diào)滑生