BCP/PC突變對慢性HBV乙型小鼠模型表型影響研究
發布時間：
2022-04-12
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研究背景與目的
乙型肝炎病毒CHepatitis B virus, HBV)感染是一個重大的公共衛生問題，全世界約有2.48億人感染HB V，其慢性感染可導致一系列嚴重的肝臟疾病，包括肝纖維化(fiver fibrosis，肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝細胞癌C hepatocellular carcinoma , HCC。HB V具有種屬特異性和組織特異性，同時還具有高復制和高突變率特性，其常見的基因突變位點為基礎核心啟動子(Basic Core Promoter，BCP)區的1762 C A1762T)和1764 C G1764A)及前核心(Pre-Core } PC)區的1896 C G1896A)和1899 C G1899A。體外實驗或臨床樣本研究已發現，B CP/PC聯合突變會阻斷或降低HBeAg表達，然而，B CP/PC聯合突變對HB V表型的更多影響尚未報道。本實驗在前期B CP/PC聯合突變 C B CP/PC C M)乙肝小鼠模型的基礎上，建立回復突變(B CP/PC C R)慢性乙型HBV小鼠模型，通過對比分析研究B CP/PC聯合突變對HB V主要標志物表型、機體免疫表型的影響，為臨床診斷和探討B CP/PC聯合突變所致的表型變化機制提供了理論依據。
前言
慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界上最常見的慢性傳染病之一，可最終導致肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝細胞癌(hepatocellular carcinonma, HCC ) }1-3}。盡管己有最新的基因工程HB V疫苗和多種抗HB V藥物的開發和應用，但HBV感染仍然是全球主要的健康問題之一，全世界大約有2.48億慢性HB V感染患者[[4]0
HB V感染機體后，其基因組由松弛環狀DNA (relaxed circular DNA, rcDNA)修飾成共價閉合環狀DNA ( Covalently closed circular DNA, cccDNA)的形式存在于感染肝細胞的細胞核中，cccDNA的持續存在是HB V不能完全消除以及停藥后復發的主要原因f5-81。從肝細胞中消除cccDNA被認為是消除慢性HB V病毒感染的
終極目標[m。應用免疫健全、能表達ccc DNA、且HB sAg能持續表達6個月的小鼠模型，是進行HB V相關研究的理想模型。
HB V具有高復制和高突變率的特性。最常見的HB V基因組變異包括基本核心啟動子(Basic core promoter, BCP)區ntA1762T/G 1764A雙突變和前核心(Pre-core, PC)區ntG 1896A/ntG 1899A的終止密碼子突變。目前己知B CP/PC突變可分別阻斷或降低HBeAg的表達「lo-lay } BCP/PC突變與野生型兩者在CHB的發病機
理，免疫力，自然臨床過程，預后和治療方面存在重大差異[[13' 14]。有研究發現BCP/PC突變會顯著增加了CHB患者發生HCC的風險[[15];也有研究表明感染BCP/PC突變病毒的CHB患者比感染BCP/PC野生型病毒的患者更容易發生重度肝炎和肝功能衰竭，感染PC突變病毒的肝功能衰竭患者死亡風險也更高「16]。在之
前的研究中，我們課題組從臨床患者血清中分離并鑒定出BCP/PC ( ntA1762T/G 1764A/G 1896A/G 1899A)聯合突變、B基因型和adw血清亞型的HB V毒株[ys}。以此毒株DNA為模板在體外合成cccDN A，通過尾靜脈高壓注射(hydrodynamic injection, HDI)方法建立了一個模擬HBeAg陰性的C_57BL/6J和CB A/C aJ小鼠模型「17' 18]。然而，這種自然BCP/PC突變毒株除HBeAg缺陷外，對HB V其它表型是否有影響仍不清楚。由于HB V的表型特性對于評估CHB患者的疾病進展和治療反應至關重要「‘”]。因此，在本研究中，我們分別以BCP/PC突變基因序列(BCP/}C CM)和回復BCP/PC突變位點后的基因序列(BCP/PC CR)
為模板，制備并鑒定了BCP/PC CM ) cccDNA和BCP/PC CR ) cccDNA。然后將不同的cccDNA HDI到CBA/CaJ小鼠中，同時建立BCP/PC (M)和BCP/PC (R)的HB V動物模型。通過對比分析的方法，精確動態的觀察天然BCP/PC突變對HB V的表型影響。
方法
1.應用分子生物學方法制備BCP/PC C R)共價閉合環狀DNAC covalently closed circular DNA, cccDNA，并測序鑒定。
2.在HepG2細胞中轉染BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA, ELISA實驗檢測HB sAg和HBeAg的分泌水平。
3.通過尾靜脈高壓注射的方法將兩種HBV cccDNA和/或生理鹽水分別注射到CBA/CaJ雄性小鼠C 8-10 w)體內，于指定時間點采取血清樣本和小鼠肝臟組織樣本。
4.通過放射免疫法檢測血清樣本中HB sAg和HBeAg的水平。
5.通過qPCR檢測小鼠血清和/或肝臟組織中HB V DNA和cccDNA的水平。
6.通過免疫組化檢測肝臟中HB sAg和HBcAg的蛋白質水平。
7.通過RT qPCR檢測肝臟中IL-1p，IL-4, IL-6和IL-10的mRNA水平。
8.通過HE染色檢測肝臟病理變化。
9.通過統計學方法分析肝臟和血清中HB V標志物的相關性。
結果
1.酶切及測序結果表明B CP/PC C R ) cccDNA構建成功。
2.在HepG2細胞中分別轉染BCP/PC CM) cccDNA和B CP/PC C R ) cccDNA o B CP/PC C M ) cccDNA轉染后，細胞培養液上清中未檢測到HBeAg，且HB sAg的水平明顯低于BCP/PC CM)組(p<0.05 > o
3. CBA/CaJ小鼠分別注射BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA后，兩種小鼠中HB V標志物(HBsAg, HBeAg, HBV DNA和cccDNA)均可持續表達26周以上。
4.在感染早期，BCP/PC CM)組小鼠血清中HB sAg和HB V DNA的水平以及肝臟中HB V DNA和cccDNA的水平均顯著低于B CP/PCCR)組(p<0.05;在整個感染期，BCP/PC CM)組小鼠血清中ALT的水平明顯高于BCP/PC CR)組(p<0.05。與BCP/PC C R)組相比，感染4周后，B CP/PC C M)組肝臟中IL-4和IL-10的mRNA水平顯著
降低;然而，感染26周后，B CP/PC C M)組肝臟中IL-4和IL-10的mRNA水平顯著升高，IL-1p的mRNA水平顯著降低。
5.感染26周后，兩組小鼠肝臟均出現炎性細胞浸潤現象，且B CP/PC C M)組的炎性細胞浸潤少于BCP/PC C R)組。
6.在兩組小鼠中，血清中HB V DNA的水平與肝細胞內HB V DNA和cccDNA的水平均呈顯著正相關。
結論
1.成功回復突變構建了B CP/PC C R ) cccDNA，并建立了B CP/PCCM)和BCP/pC CR)慢性乙型肝炎小鼠模型。B CP/PC C R)組小鼠血清HBeAg的表達持續陽性，兩組小鼠中的HB V標志物均能穩定表達26w以上。
2. BCP/PC突變導致小鼠感染早期血清及肝臟中HB V標志物水平降低，以及整個感染周期血清中ALT水平升高。
3.血清中HB V DNA水平比HB sAg更好地反映肝細胞內HBV復制程度和cccDNA拷貝數。
4. BCP/PC突變導致小鼠感染后期炎癥反應減輕，其機制可能是在感染早期，B CP/PC突變抑制小鼠肝臟中Th2細胞因子的表達，而在感染后期，抑制Thl細胞因子的表達。
關鍵詞:B CP/PC突變，表型，慢性乙型肝炎，小鼠模型，共價閉合環狀DNA
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