PD-1基因敲除T細(xì)胞治療結(jié)直腸癌的有效性及其體內(nèi) 安全性評(píng)價(jià)的臨床前研究

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-20

來源：

專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤(rùn)色)

作者：

吉妮歐

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成功獲得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA，構(gòu)建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表達(dá)載體，建立小鼠PD-1基因敲除T細(xì)胞，對(duì)其體外特性進(jìn)行檢測(cè)

　　研究背景與目的
　　靶向T細(xì)胞抑制性檢測(cè)點(diǎn)腫瘤免疫治療是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究的最熱點(diǎn)。研究表明，利用單抗藥物直接作用于PD-1可以有效地阻斷抑制性免疫檢測(cè)點(diǎn)，激活T細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞的功能，達(dá)到治療腫瘤的目的。在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，腸道由于接觸抗原的表面積最大并且免疫細(xì)胞數(shù)量較多，因而被認(rèn)為是體內(nèi)最大的免疫器官I1，發(fā)生于結(jié)直腸的惡性腫瘤與免疫逃逸有關(guān)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)T細(xì)胞PD-1基因進(jìn)行靶向敲除，采用小鼠結(jié)腸癌模型進(jìn)行PD-1基因敲除的T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用及其可能機(jī)制研究，采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，高度模擬PD-1基因敲除T細(xì)胞在體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)，以期建立利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向T細(xì)胞PD-1基因進(jìn)行腫瘤細(xì)胞免疫治療的策略，進(jìn)而為臨床研究的實(shí)施奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。（推薦閱讀：T84人結(jié)直腸癌細(xì)胞、LIM1215人結(jié)直腸癌細(xì)胞、SW837人直腸癌細(xì)胞、DIFI人結(jié)直腸癌細(xì)胞）
　　【方法】
　　在GENEBANK 數(shù)據(jù)庫中查找獲得小鼠PD-1基因序列，設(shè)計(jì)靶向小鼠PD-1基因的sgRNA，構(gòu)建靶向PD-1基因的PX458敲除載體，經(jīng)擴(kuò)增、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的CRISPR/Cas9-sgRNA表達(dá)載體。分離獲得小鼠外周血PBMC，富集細(xì)胞數(shù)量為1x107，加入敲除PD-1基因的PX458敲除載體5μg，采用Lonza-4D電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，48h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，采用PCR技術(shù)和T7E1 酶切驗(yàn)證PD-1基因的敲除。體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT-26，分為∶陰性對(duì)照組∶CT-26細(xì)胞組、PD-1基因敲除T細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組∶CT-26與PD-1基因敲除T細(xì)胞共培養(yǎng)組，CT-26與未經(jīng)PD-1基因敲除的T細(xì)胞及PD-1單抗共培養(yǎng)組。繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PD-1基因敲除的T細(xì)胞的殺傷能力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群比例的變化及體外分泌細(xì)胞因子的水平變化。
　　【結(jié)果】
　　成功獲得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA，構(gòu)建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表達(dá)載體，建立小鼠PD-1基因敲除T細(xì)胞，對(duì)其體外特性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示∶流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-1基因敲除T細(xì)胞CD3、CD4、CD8比例無明顯變化；PD-1基因敲除T細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT-26在不同效靶比作用下體外抑制腫瘤效應(yīng)結(jié)果顯示∶各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示∶與其他兩組相比，CT-26 與PD-1基因敲除T細(xì)胞共培養(yǎng)組，CT-26與未經(jīng)PD-1基因敲除T細(xì)胞及PD-1 單抗共培養(yǎng)組，72小時(shí)細(xì)胞活率明顯下降，與其他兩組相比，CT-26與PD-1基因敲除T細(xì)胞共培養(yǎng)組，CT-26與PD-1基因敲除T細(xì)胞及PD-1單抗共培養(yǎng)組，與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后∶IFN-y、TNF-α、IL-2的水平增加。【結(jié)論】
　　建立了穩(wěn)定的體外定向敲除T細(xì)胞抑制性免疫檢測(cè)點(diǎn)PD-1的技術(shù)，獲得了小鼠同種異體PD-1基因敲除T細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)顯示，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為體內(nèi)抗腫瘤的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　【關(guān)鍵詞】
　　CT-26，sgRNA，CRISPR/Cas9，體外研究；