PD-1基因敲除T細胞治療結直腸癌的有效性及其體內 安全性評價的臨床前研究
發布時間：
2022-04-20
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研究背景與目的
靶向T細胞抑制性檢測點腫瘤免疫治療是當今生物醫學研究的最熱點。研究表明，利用單抗藥物直接作用于PD-1可以有效地阻斷抑制性免疫檢測點，激活T細胞，增強T細胞的功能，達到治療腫瘤的目的。在機體的免疫系統中，腸道由于接觸抗原的表面積最大并且免疫細胞數量較多，因而被認為是體內最大的免疫器官I1，發生于結直腸的惡性腫瘤與免疫逃逸有關。本研究利用CRISPR/Cas9技術對T細胞PD-1基因進行靶向敲除，采用小鼠結腸癌模型進行PD-1基因敲除的T細胞的體內抗腫瘤作用及其可能機制研究，采用非人靈長類動物食蟹猴作為實驗動物，高度模擬PD-1基因敲除T細胞在體內的安全性評價，以期建立利用CRISPR/Cas9技術靶向T細胞PD-1基因進行腫瘤細胞免疫治療的策略，進而為臨床研究的實施奠定堅實的實驗基礎。（推薦閱讀：T84人結直腸癌細胞、LIM1215人結直腸癌細胞、SW837人直腸癌細胞、DIFI人結直腸癌細胞）
【方法】
在GENEBANK 數據庫中查找獲得小鼠PD-1基因序列，設計靶向小鼠PD-1基因的sgRNA，構建靶向PD-1基因的PX458敲除載體，經擴增、酶切鑒定及測序驗證，獲得正確的CRISPR/Cas9-sgRNA表達載體。分離獲得小鼠外周血PBMC，富集細胞數量為1x107，加入敲除PD-1基因的PX458敲除載體5μg，采用Lonza-4D電轉儀進行電轉染，48h后檢測轉染效率，采用PCR技術和T7E1 酶切驗證PD-1基因的敲除。體外培養結直腸癌細胞株CT-26，分為∶陰性對照組∶CT-26細胞組、PD-1基因敲除T細胞組，實驗組∶CT-26與PD-1基因敲除T細胞共培養組，CT-26與未經PD-1基因敲除的T細胞及PD-1單抗共培養組。繪制各組細胞生長曲線，細胞殺傷檢測試劑盒檢測PD-1基因敲除的T細胞的殺傷能力，通過流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群比例的變化及體外分泌細胞因子的水平變化。
【結果】
成功獲得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA，構建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表達載體，建立小鼠PD-1基因敲除T細胞，對其體外特性進行檢測，結果顯示∶流式細胞儀檢測PD-1基因敲除T細胞CD3、CD4、CD8比例無明顯變化；PD-1基因敲除T細胞與結直腸癌細胞株CT-26在不同效靶比作用下體外抑制腫瘤效應結果顯示∶各組細胞生長曲線示∶與其他兩組相比，CT-26 與PD-1基因敲除T細胞共培養組，CT-26與未經PD-1基因敲除T細胞及PD-1 單抗共培養組，72小時細胞活率明顯下降，與其他兩組相比，CT-26與PD-1基因敲除T細胞共培養組，CT-26與PD-1基因敲除T細胞及PD-1單抗共培養組，與腫瘤細胞共培養后∶IFN-y、TNF-α、IL-2的水平增加。【結論】
建立了穩定的體外定向敲除T細胞抑制性免疫檢測點PD-1的技術，獲得了小鼠同種異體PD-1基因敲除T細胞，體外實驗顯示，可抑制腫瘤細胞的生長，為體內抗腫瘤的研究奠定了基礎。
【關鍵詞】
CT-26，sgRNA，CRISPR/Cas9，體外研究；
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