類器官的研究現(xiàn)狀及其作為臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膽?yīng)用

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-29

來源：

專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫(kù)源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤(rùn)色)

作者：

吉妮歐

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類器官與二維培養(yǎng)的細(xì)胞相比更接近原位組織的生理功能，相比于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，類器官的操作更加簡(jiǎn)單直觀，并且為那些在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中無(wú)法準(zhǔn)確建模的實(shí)驗(yàn)提供了一種替代方法

　　摘要
　　體外培養(yǎng)的類器官主要由成體干細(xì)胞和多能干細(xì)胞分化而來。現(xiàn)已培養(yǎng)出腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、腦、肝臟等多種類型的類器官。作為一種新興的模擬人體器官發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程的研究模型，已在疾病建模、篩選抗癌藥物、藥物開發(fā)、基因及細(xì)胞療法中得到廣泛的應(yīng)用。該文主要針對(duì)培養(yǎng)體系成熟類器官的研究現(xiàn)狀及類器官作為疾病的臨床前模型的應(yīng)用作一綜述。
　　關(guān)鍵詞類器官；干細(xì)胞；動(dòng)物疾病模型；藥物開發(fā)；細(xì)胞療法,臨床前CRO,動(dòng)物實(shí)驗(yàn),動(dòng)物造模
　　哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞具有自組織能力，在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)可得到具有三維構(gòu)象的培養(yǎng)物。近年來對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，2009年Sato et al通過在基質(zhì)膠中培養(yǎng)富含亮氨酸重復(fù)序列 G-蛋白偶聯(lián)受體5（LGR5）基因表達(dá)的腸道干細(xì)胞率先完成小腸類器官的體外構(gòu)建。
　　隨后視網(wǎng)膜、大腦、肝、腎等類器官相繼誕生。其基本原理是按照特定的時(shí)間添加干細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種誘導(dǎo)因子，使具有分化潛能的細(xì)胞自發(fā)分化成相應(yīng)的類器官。類器官可以在體外培養(yǎng)體系中廣泛擴(kuò)增并且能夠長(zhǎng)期保持生理及遺傳信息的穩(wěn)定，類器官的組織可來源于患者，因此在作為臨床前模型方面有著獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。該文綜述了幾種體外培養(yǎng)體系成熟的類器官的研究現(xiàn)狀及其作為臨床前模型的應(yīng)用。
　　1 成體干細(xì)胞構(gòu)建類器官
　　成體干細(xì)胞位于分化成熟的組織器官之中，分離的成體干細(xì)胞在添加適當(dāng)細(xì)胞因子的體外培養(yǎng)體系中可以誘導(dǎo)成相應(yīng)的類器官。
　　1.1小腸類器官
　　Sato et al在前人對(duì)腸道干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境研究的基礎(chǔ)上，分離腸道隱窩，在富含層黏連蛋白的基質(zhì)膠中培養(yǎng) LGR5 基因表達(dá)的腸道干細(xì)胞，待基質(zhì)膠完全聚合后，加入干細(xì)胞增殖、分化所需的 R脊椎蛋白1、表皮生長(zhǎng)因子和頭蛋白等細(xì)胞因子。在這個(gè)體外培養(yǎng)系統(tǒng)中成功的培養(yǎng)出了具有隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的小腸上皮即小腸類器官，經(jīng)過驗(yàn)證，該小腸類器官含有腸道上皮所有的細(xì)胞類型。小腸類器官成熟后能以1∶5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并且能在體外培養(yǎng)體系中連續(xù)傳代培養(yǎng)超過1.5年，且在此過程中依然保持基因型及生理功能的穩(wěn)定。
　　1.2 腎臟類器官
　　腎的功能單位由腎小球和腎小管組成，其功能依賴于其復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。腎在發(fā)育過程需要中胚層的輸尿管芽與后腎間質(zhì)之間的相互作用。Li et al在適當(dāng)?shù)娜S培養(yǎng)條件下.培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的腎單位祖細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了腎單位祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中的長(zhǎng)期擴(kuò)增，擴(kuò)增的腎單位祖細(xì)胞依然能保持基因組的穩(wěn)定性、分子的均一性和發(fā)育成腎臟的潛能。培養(yǎng)的腎單位祖細(xì)胞可以形成腎臟類器官，植入新生小鼠及雞胚體內(nèi)的腎臟類器官可以與循環(huán)系統(tǒng)建立聯(lián)系，形成異位腎樣結(jié)構(gòu)，將腎類器官移植到免疫缺陷小鼠網(wǎng)膜中，可產(chǎn)生尿液樣濾液。
　　1.3 生殖系統(tǒng)類器官
　　在生殖系統(tǒng)中，利用非妊娠女性子宮內(nèi)膜和蛻膜的樣本，建立了遺傳穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜類器官，這些類器官可以對(duì)性激素的作用產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并在催乳素和胎盤激素刺激下再現(xiàn)了妊娠期子宮內(nèi)膜特征性的早孕信號(hào)，這為了解早期妊娠期間子宮內(nèi)膜分泌和子宮內(nèi)膜-胎盤之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。此外，男性生殖系統(tǒng)的類器官培養(yǎng)也取得了一些進(jìn)展。Baert et al刀發(fā)現(xiàn)人類初級(jí)睪丸細(xì)胞在新生小鼠睪丸類器官培養(yǎng)的條件下能夠自組織成人睪丸類器官，盡管缺乏睪丸特異性的形貌，但這些微小組織中存在精原細(xì)胞及其重要的細(xì)胞生態(tài)位，同時(shí)這些細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中仍保留著特定的功能，這表明體外再造人睪丸微環(huán)境是可能的。
　　2 多能干細(xì)胞類器官構(gòu)建
　　多能干細(xì)胞包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，此兩種多能干細(xì)胞類型均可以自我更新并分化成所有的細(xì)胞類型，多能干細(xì)胞的這一特性為類器官的構(gòu)建提供了理論支持。類器官的發(fā)展得益于人們對(duì)器官生長(zhǎng)微環(huán)境的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，由于來源于多能干細(xì)胞的類器官是同質(zhì)群體經(jīng)過不同的階段定向分化形成的，因此在培養(yǎng)過程中需要?jiǎng)討B(tài)調(diào)整其階段性的微環(huán)境。
　　在二維培養(yǎng)的條件中，多能干細(xì)胞在沒有任何誘導(dǎo)信號(hào)的情況下，會(huì)成為神經(jīng)元，分化的神經(jīng)上皮細(xì)胞可以自組織成神經(jīng)前體細(xì)胞花環(huán)結(jié)構(gòu)。在此研究基礎(chǔ)上，Eiraku e al建立了神經(jīng)外胚層類器官，這些類器官中的神經(jīng)元表現(xiàn)出新生皮層腦組織的特性，并且類器官培養(yǎng)重現(xiàn)了早期皮質(zhì)發(fā)生過程中的時(shí)空調(diào)控，通過這種方法產(chǎn)生的神經(jīng)上皮細(xì)胞受到刺激后，表現(xiàn)出特定的腦區(qū)功能特性。研究表明神經(jīng)上皮細(xì)胞在基質(zhì)膠中三維培養(yǎng)時(shí)，通過特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)，神經(jīng)上皮細(xì)胞可自組織成由視網(wǎng)膜色素上皮和神經(jīng)上皮組成的視杯。形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄分析表明.這些大腦類器官包含了大腦相互依賴的各個(gè)部分。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序顯示大腦類器官中具有祖細(xì)胞和分化表型的神經(jīng)細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)在類器官和胎兒組織之間發(fā)現(xiàn)了顯著的轉(zhuǎn)錄相似性，這為大腦類器官可作為人類皮質(zhì)發(fā)育模型提供了依據(jù)。
　　同樣，多能干細(xì)胞來源的肝類器官的構(gòu)建已有報(bào)道。用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序法在二維培養(yǎng)的多能性的基礎(chǔ)上重建了肝細(xì)胞譜系，之后在體外重建了肝臟、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，解構(gòu)了肝芽發(fā)育過程中的異質(zhì)性，最終成功構(gòu)建了肝芽類器宜。將肝芽類器宜與胎兒和成人肝臟單細(xì)胞RNA 序列數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)肝芽類器官與胎兒肝細(xì)胞之間存在顯著的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這為闡明肝臟發(fā)生發(fā)展提供了更加直接的證據(jù)。
　　3 應(yīng)用
　　3.1 疾病模型
　　腸類器官可以高度還原腸上皮細(xì)胞的體內(nèi)生理環(huán)境和組織結(jié)構(gòu)特征，并且可以排除腸道其他因素對(duì)研究的干擾，使得單獨(dú)研究某種致病因素對(duì)腸道上皮的影響成為可能，因此在腸道感染性疾病研究中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。腹瀉病現(xiàn)在仍然是世界上最大的健康問題之一，利用結(jié)腸、小腸類器宜模擬腸道感染既能研分宿主一病原體的相互作用，又能尋找治療靶點(diǎn)。輪狀病毒感染至今依然是威脅兒童健康的一大問題，每年導(dǎo)致超過 45萬(wàn)5歲以下兒童死亡。人源性腸類器宜易受輪狀病毒感染目對(duì)輪狀病毒感染較為鐓感，學(xué)感染的腸類器官能夠產(chǎn)生感染性輪狀病毒顆粒，使用干擾素α或利巴韋林治療可抑制輪狀病毒在人及小鼠腸類器官中的復(fù)制。重要的是，人源性腸類器官能有效支持患者來源的輪狀病毒棟的感染.并有可能用干抗病毒藥物療效的個(gè)性化評(píng)估。二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）是嘧啶從頭生物合成途徑中的限速酶。研究表明 DHODH抑制劑——布雷奎納（BOR）和來氟米特（LFM）在常規(guī)人腸Caco2細(xì)胞系以及人腸類器官中強(qiáng)烈抑制輪狀病毒復(fù)制。BQR 和 LFM通過靶向 DHODH 消耗嘧啶核苷酸池發(fā)揮其抗輪狀病毒作用。因此，靶向嘧啶的生物合成代表了開發(fā)針對(duì)輪狀病毒的抗病毒策略的潛在方法。此外，小腸類器官模型同樣已用來研究諾如病毒，早狀病毒等腸道感染性疾病。
　　3.2 篩選抗癌藥物
　　現(xiàn)已成功從結(jié)腸、肝臟、乳腺和胰腺的原發(fā)性腫瘤中培養(yǎng)出相應(yīng)的腫商類器官。Vlachogiamnis eta（可從人源性的轉(zhuǎn)移性胃腸道胞瘤組織中培養(yǎng)出腫瘤類器官，并在體外再現(xiàn)了這些患者對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)。研究證實(shí)人源性腫瘤類器官的表型和基因型與原發(fā)腫瘤有高度的相似性并且原發(fā)腫瘤細(xì)胞的特性可以在腫瘤類器官中保留，同時(shí)腫瘤類器官的分子分析與藥物篩選結(jié)果相匹配。在預(yù)測(cè)患者對(duì)靶向藥物或化療的反應(yīng)方面有100%的敏感性、93% 的特異性、88% 的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和100%的陰性預(yù)測(cè)值。人源性腫瘤類器官還可以用于腫瘤的功能基因組學(xué)研究，在體外模擬腫瘤行為，并將分子病理學(xué)應(yīng)用到早期臨床試驗(yàn)的決策過程中。人源性腫瘤類器官可以在體外再現(xiàn)患者對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)，這些患者組織來源的腫瘤類器官作為益床前模型在篩選個(gè)體對(duì)抗腫商藥物的治療反應(yīng)方面有很強(qiáng)的特異性，腫瘤類器宜的構(gòu)建有望實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物使用的個(gè)性化。類器官模型同樣在腫瘤耐藥方面有著巨大的應(yīng)用潛力.對(duì)于耐藥機(jī)制的研究及藥物篩選方面有著巨大的應(yīng)用空間。
　　3.3 藥物開發(fā)
　　藥物開發(fā)是一個(gè)低效率、資源密集的過程，在大多數(shù)情況下新藥開發(fā)很難獲得成功。由于許多藥物在Ⅲ期試驗(yàn)中失敗或上市后才發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重副作用，因此開發(fā)新藥的平均成本往往超過10億美元，這使得研究人員在選擇最適合藥物開發(fā)的臨床前模型的過程變得尤為重要"。動(dòng)物模型的可預(yù)測(cè)性有限導(dǎo)致了90%的藥物在人體試驗(yàn)中失敗回。動(dòng)物模型與人體的差異同樣可能使研究者錯(cuò)過本有治療效果的藥物，因?yàn)樵趧?dòng)物身上的副作用不一定轉(zhuǎn)化為人類。這些假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果造成了巨大的財(cái)政負(fù)擔(dān)，從而導(dǎo)致在決策過程中，更注重藥物的潛在盈利能力而不是潛在的疾病治愈能力。類器官在結(jié)構(gòu)和功能上更接近人體，可以作為更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)藥物毒性的模型，現(xiàn)已證明腎臟類器官能夠預(yù)測(cè)黑磷量子點(diǎn)和順鉑!"|的腎毒性作用。此外，由于小腸上皮細(xì)胞含有大量的藥物代謝酶和外源加工蛋白，在藥物和外源物質(zhì)的代謝、消化、營(yíng)養(yǎng)吸收等過程中起著至關(guān)重要的作用，因此小腸類器官作為臨床前模型現(xiàn)已用于藥物開發(fā)。神經(jīng)元類器官作為神經(jīng)疾病的研究模型在藥物開發(fā)方面也已取得一些進(jìn)展，例如與Timothy綜合征突變相關(guān)的L型鈣通道的藥物調(diào)節(jié)劑，該藥可恢復(fù)皮層神經(jīng)元的遷移。此外，神經(jīng)元類器官在與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中再現(xiàn)了血腦屏障的特征，從而為篩選靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物提供了可能。因此，類器官因其對(duì)人體器官結(jié)構(gòu)和功能的高度還原，在測(cè)試藥物作用及副作用方面有著巨大的應(yīng)用空間。
　　3.4 基因和細(xì)胞療法
　　將結(jié)腸、肝臟、視網(wǎng)膜類器官分別移植到對(duì)應(yīng)的受體器官中可觀察到移植的類器官與受體發(fā)生功能整合。將體外培養(yǎng)的結(jié)腸類器官移植到小鼠結(jié)腸上皮損傷部位，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸類器官會(huì)很快與小鼠結(jié)腸受損部位發(fā)生整合，覆蓋上皮損傷部位，4周后供者來源的細(xì)胞形成單層上皮，形成功能和組織結(jié)構(gòu)正常的上皮結(jié)構(gòu)，并能維持上皮的更新，這給腸道損傷修復(fù)提供了一個(gè)新的治療策略。人的胰腺類器官移植到免疫缺陷小鼠后能形成胰島素分泌細(xì)胞，利用胰腺類器官移植來降低血糖已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。現(xiàn)已有一些支持細(xì)胞療法可行性的證據(jù)，包括與自然組織的形態(tài)學(xué)相似性、建立與受體的聯(lián)系、上皮通透性和對(duì)疾病及損傷的修復(fù)的能力。利用CRISPR/Cas 9基因組編輯技術(shù)，通過同源重組來糾正囊性纖維化患者腸干細(xì)胞中的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的突變，恢復(fù)了囊性纖維化患者結(jié)腸器官中囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白的功能。
　　這些研究表明，在未來的細(xì)胞治療方法中，類器官可能是細(xì)胞的來源。然而，還需要更多的研究來評(píng)估這種方法的有效性和安全性。
　　4 展望
　　類器官在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中擁有著廣泛的前景，可以為器官移植提供新的思路。但仍存在許多挑戰(zhàn)，如動(dòng)物源性和化學(xué)成分未明的細(xì)胞外基質(zhì)之間的可變性可能會(huì)影響高通量篩選。因此在將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用時(shí)，此類外源性物質(zhì)的作用使得轉(zhuǎn)化過程也有存在問題的可能。為了解決這些問題，科學(xué)工作者正在開發(fā)能夠根據(jù)需要改變其生物物理和生物化學(xué)性質(zhì)的合成基質(zhì)。此外，在體外培養(yǎng)體系培養(yǎng)類器官時(shí)會(huì)缺乏一些重要的生理過程，包括血管化和神經(jīng)支配，這可能會(huì)阻礙類器官的研究。
　　另外，在類器官體外培養(yǎng)體系中對(duì)生物物理外環(huán)境的控制、模擬組織-組織間的聯(lián)系方面也存在挑戰(zhàn)。為更精確地模擬體內(nèi)器官的內(nèi)環(huán)境及器官之間的相互作用，研究人員開發(fā)了類器官芯片，利用微流控技術(shù)更好地模擬器官生存的體內(nèi)環(huán)境及實(shí)現(xiàn)多器官的聯(lián)動(dòng)，但要真正實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)環(huán)境的精準(zhǔn)模擬依舊任重道遠(yuǎn)。雖然類器官技術(shù)的應(yīng)用依然存在諸多挑戰(zhàn)，但其正以極其強(qiáng)勁的勢(shì)頭發(fā)展，隨著體外培養(yǎng)技術(shù)的逐日完善及各種組織類器官的構(gòu)建，這必將為疾病機(jī)制的探究、個(gè)體化治療及藥物開發(fā)提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br /> 　　綜上所述，類器官與二維培養(yǎng)的細(xì)胞相比更接近原位組織的生理功能，相比于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，類器官的操作更加簡(jiǎn)單直觀，并且為那些在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中無(wú)法準(zhǔn)確建模的實(shí)驗(yàn)提供了一種替代方法。
　　可以為器官發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和發(fā)病機(jī)制提供更直接的認(rèn)知，并可能為疾病的診斷和治療提供新的轉(zhuǎn)化途徑。患者組織來源的類器官可作為臨床前模型，給臨床研究開辟新的轉(zhuǎn)化途徑。
　　類器官技術(shù)是一項(xiàng)有著廣闊應(yīng)用前景的新型技術(shù)，可能會(huì)給生物醫(yī)學(xué)研究提供新的視角，完善類器官技術(shù)需要多學(xué)科的合作，以實(shí)現(xiàn)對(duì)人體環(huán)境的精準(zhǔn)模擬及調(diào)控。