不同方法建立長(zhǎng)期慢性高尿酸血癥模型及對(duì)相關(guān)并發(fā)癥影響的研究進(jìn)展

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2022-05-18

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隨著發(fā)病率的逐年升高∶HUA長(zhǎng)期慢性所伴隨的并發(fā)癥問(wèn)題亦浮出水面。當(dāng)前，大多數(shù)動(dòng)物模型僅用于短期降尿酸修選，關(guān)于其長(zhǎng)期并發(fā)癥甚少

　　摘要∶
　　高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA））在人類(lèi)中具有較高的發(fā)病率，且其與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、心血管疾病以及肝腎功能損傷等多種疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究顯示，HUA 相關(guān)并發(fā)癥需要長(zhǎng)期穩(wěn)定的誘導(dǎo)過(guò)程。
　　與人類(lèi)不同的是，常用模式動(dòng)物具有較高的尿酸酶表達(dá)，可迅速將尿酸分解成可溶性尿囊素排泄出體外，該特點(diǎn)易造成造模期間高尿酸日均暴露時(shí)間不足。因此，HUA 相關(guān)并發(fā)癥的觀察對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谀Ｊ絼?dòng)物、誘導(dǎo)方式、高尿酸暴露時(shí)間等方面均有較高的要求。
　　本文對(duì)HUA 動(dòng)物模型造模方法以及不同造模方法對(duì)慢性并發(fā)癥的影響進(jìn)行綜述，重點(diǎn)從主流藥物造模方法的優(yōu)劣分析、模式動(dòng)物的選擇、基因干預(yù)造模3個(gè)方面展開(kāi)，為HUA 長(zhǎng)期并發(fā)癥研究的造模方法選擇提供參考依據(jù)。
　　關(guān)鍵詞∶
　　高尿酸血癥（HUA）;造模;并發(fā)癥
　　高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是機(jī)體內(nèi)尿酸生成過(guò)多或/和排泄障礙造成的尿酸體內(nèi)積聚的現(xiàn)象。2019 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)發(fā)布的《中國(guó)高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南》指出，非同日、2次空腹血尿酸大于420 umol/L（成年人，不分男性、女性）即可診斷為HUA。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，HUA發(fā)病率呈逐年升高且年輕化趨勢(shì)。長(zhǎng)期HUA 可誘發(fā)多種并發(fā)癥，如痛風(fēng)、II型糖尿病、心血管疾病、肝腎功能損傷等。當(dāng)前應(yīng)用的HUA動(dòng)物模型大多數(shù)為考察尿酸體內(nèi)生成和排泄，這僅需要?jiǎng)游锒唐诰S持高水平尿酸即可達(dá)到研究目的。然而，HUA相關(guān)并發(fā)癥是長(zhǎng)期高尿酸慢性誘導(dǎo)作用下的結(jié)果。為更真實(shí)模擬和研究人體 HUA并發(fā)癥的病理誘導(dǎo)過(guò)程，構(gòu)建長(zhǎng)期、穩(wěn)定的HUA動(dòng)物模型顯得尤為重要。本綜述從主流藥物造模方法、模式動(dòng)物選擇和基因干預(yù)造模3個(gè)方面，對(duì)當(dāng)前HUA 模型構(gòu)建方法的長(zhǎng)期應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)劣評(píng)價(jià)，并展望新型模型和技術(shù)的未來(lái)發(fā)展方向，為今后 HUA長(zhǎng)期并發(fā)癥體內(nèi)研究的模型選擇提供參考。
　　1 主流藥物造模方法的優(yōu)劣分析
　　1.1 用于HUA 造模的藥物及其作用機(jī)制
　　當(dāng)前，大部分實(shí)驗(yàn)使用較多的造模方法仍是以通過(guò)藥物干預(yù)為主的方式增加尿酸來(lái)源、抑制尿酸代謝及排泄，主要造模藥物包括氧嗪酸鉀（（potassium oxonate，PO）、次黃嘌呤（hypoxanthine，HX）、腺嘌呤（adenine，AD）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）、煙酸（nicotinic acid，NA）、果糖（fructose，F(xiàn)RU）、酵母（veast.YE）等。文中匯總了這些造模誘導(dǎo)劑的機(jī)制、給藥方式，并對(duì)成模性進(jìn)行評(píng)價(jià)（表1）。根據(jù)造模藥物的作用機(jī)制，現(xiàn)有的研究提示，基于氧嗪酸鉀和次黃嘌吟的模型更有利干評(píng)價(jià)尿酸的生成以及重吸收.而基干腺嘌呤的模型更有利于評(píng)價(jià)HUA下的腎臟損傷及干預(yù)保護(hù)，基于果糖的模型更有利干評(píng)價(jià) HUA 合并糖尿病等代謝性紊亂的機(jī)制及改善效應(yīng)。單獨(dú)應(yīng)用乙胺丁醇及煙酸誘導(dǎo)HUA鮮有報(bào)道，其常與外源性尿酸前體物質(zhì)聯(lián)合誘導(dǎo)。
　　1.2 聯(lián)合造模在慢性 HUA并發(fā)癥中的應(yīng)用
　　HUA并發(fā)癥的自發(fā)性誘導(dǎo)需要維持組織器官每日的高尿酸暴露時(shí)間以及誘導(dǎo)周期。由于非靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物大都表達(dá)尿酸酶，當(dāng)誘導(dǎo)劑代謝或排泄后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的尿酸水平迅速回落。單一誘導(dǎo)劑往往難以觀察到并發(fā)癥現(xiàn)象，在當(dāng)前研究中，人們常常需使用兩種以上的聯(lián)合造模劑誘導(dǎo)組織器官的慢性病變。聯(lián)合藥物誘導(dǎo) HUA 并研究其并發(fā)癥的模型較多，并無(wú)均一標(biāo)準(zhǔn)，鮮有文獻(xiàn)系統(tǒng)性評(píng)價(jià)方法的適用性。我們整理了現(xiàn)有聯(lián)合造模誘導(dǎo)方法對(duì)尿酸水平以及并發(fā)癥的誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合造模模型藥物選擇中，氧嗪酸鉀是絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的選擇，其聯(lián)合腺嘌呤、次黃嘌呤、酵母膏在尿酸升高倍數(shù)上均有較好的表現(xiàn)。但是，當(dāng)前關(guān)于HUA并發(fā)癥的研究多集中于腎臟損傷，對(duì)其他組織器官損傷的模型探索較少。
　　2模式動(dòng)物選擇
　　由于生理病理過(guò)程與人類(lèi)相似且飼養(yǎng)方便，大多數(shù)研究選擇嚙齒類(lèi)動(dòng)物作為HUA 的模式動(dòng)物，包括SD大鼠、昆明小鼠和C57小鼠等。然而，不同于人類(lèi)的是，這些動(dòng)物均能合成尿酸酶，在體內(nèi)將尿酸代謝為可排泄的尿囊素。這一特征正是當(dāng)前藥物誘導(dǎo)劑造模難以保證組織器官長(zhǎng)期持續(xù)性高濃度尿酸暴露的原因，這亦使得相關(guān)并發(fā)癥難以被觀察到。
　　相比而言，禽類(lèi)的嘌呤代謝途徑與人類(lèi)更為相似，其僅需在基礎(chǔ)飼料中添加次黃嘌呤、酵母等尿酸前體物質(zhì)或腺嘌呤影響尿酸排泄即可誘導(dǎo)穩(wěn)定的 HUA 模型。當(dāng)前，常用的以禽類(lèi)為主的 HUJA模型主要選擇雞或鵪鶉作為模式動(dòng)物。在雄性迪法克鵪鶉飼料中添加 15g/kg 的酵母粉，飼喂140天后血清尿酸水平顯著性升高，在第60天時(shí)研究人員可檢測(cè)到血清甘油三酯水平的顯著性上升，第 90天時(shí)血清葡萄糖水平呈現(xiàn)顯著性上升。同時(shí)，該模型中血清黃嘌吟氧化酶以及胰島素水平均顯著性升高，這是機(jī)體氧化應(yīng)激以及胰島素耐受的表現(xiàn)，也是多器官損傷的病理基礎(chǔ)。然而，在該研究總計(jì)140 天的實(shí)驗(yàn)周期中，肝腎功能的顯著性變化并未被觀察到P39】。該模型的規(guī)律與人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)規(guī)律改變類(lèi)似，可用于模擬自然慢性損傷，其存在實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)的缺占。近年來(lái)有研究表明。在高脂高嘌吟飲食的基礎(chǔ)上皮下注射氧嗪酸鉀200 mg/kg 可進(jìn)一步提升鵪鶉血清尿酸水平約1.5倍，且在 14 周后可觀察到主動(dòng)脈壁的脂質(zhì)次積、斑塊形成。以人及腎小球的脂質(zhì)匯和和腎小管的空泡戀性。這文說(shuō)明通過(guò)進(jìn)一步提高尿酸水平可加速 HUJA 并發(fā)癥進(jìn)程。然而，當(dāng)前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室缺乏進(jìn)行禽類(lèi)飼養(yǎng)的條件，在模型推廣上或許有一定難度。
　　近年來(lái)，基于斑馬魚(yú)的疾病模型受到廣泛關(guān)注，斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因高度同源，生物結(jié)構(gòu)與生理功能和人類(lèi)亦高度相似，且其有易于繁殖、實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)藥量小、給藥方式簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前，基于斑馬魚(yú)的HUA模型尚處于摸索的起步階段。研究顯示，使用200 μmol/L 氧嗪酸鉀聯(lián)合 10umol/L黃嘌呤可提升斑馬魚(yú)體內(nèi)尿酸水平約2倍，該方法可作為急性HUA 模型，該模型可應(yīng)用于化合物的降尿酸效果的快速評(píng)估。然而，作為新興模式動(dòng)物，當(dāng)前斑馬魚(yú)的 HUA造模方法缺乏長(zhǎng)期慢性狀態(tài)下的有效性評(píng)估。
　　靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的尿酸合成代謝途徑與人類(lèi)最為相似，但由于其飼養(yǎng)難度大以及實(shí)驗(yàn)成本高昂，鮮少用于HUA 相關(guān)研究。近期研究顯示，給予雄性恒河猴 200 mg/kg 肌苷腹腔注射1 h后，血清尿酸濃度提高約4倍;然而，4 h 后血清尿酸即回落至基線。該方法并不適用于長(zhǎng)期慢性 HUA 及相關(guān)并發(fā)癥影響的評(píng)估。
　　3 基因干預(yù)造模
　　3.1 當(dāng)前針對(duì)HUA的基因干預(yù)靶點(diǎn)
　　尿酸在動(dòng)物體內(nèi)可在尿酸酶作用下降解為可溶性尿囊素排出體外，或通過(guò)腎臟和腸道排泄。因此，當(dāng)前基因干預(yù)靶點(diǎn)主要分布于編碼尿酸酶的 UOX（urate oxidase）、負(fù)責(zé)腎臟重吸收的 URAT1（urate transporter 1）和 GLUT9（glucose transporter 9），以及負(fù)責(zé)腸道排泄的ABCG2（ATP-binding cassette transporter; subfamily G，member 2）。近年，基于全基因組關(guān)聯(lián)的研究顯示，GLUT12（glucose transporter 12）是一種生理性尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致血尿酸濃度的升高，提示其或許可以作為新的干預(yù)靶點(diǎn)。此外，在腸道排泄中，PDZK1（PDZdomain-containing 1）和 ABCG2 的表達(dá)高度相關(guān)，敲除 PDZK1 可間接性導(dǎo)致ABCG2 的表達(dá)同步下調(diào)，進(jìn)而減少尿酸腸道排泄。3.2 基因干預(yù)對(duì)尿酸水平的影響
　　如表3所示，當(dāng)前研究中針對(duì)HUA的基因干預(yù)造模所選用的小鼠以C57BL 系列為主，不同基因的敲除對(duì)于模型動(dòng)物的獲得數(shù)以及尿酸水平的提高具有較大差異。UOX敲除口|以何得血尿校水平大幅升高，然而其死工率也較高。因此其操作性并不強(qiáng)。IRAT1的高除并不能使得尿酸水平顯著性升高，因此不適用于建立 HUA模型。GLU79 的敲除，在系統(tǒng)性敲除和特定組織器官敲除中具有不同的效果，系統(tǒng)性敲除GLU/79具有胚胎致死性，而肝特異性敲除則沒(méi)有，且可大幅升高血尿酸濃度。
　　3.3 基因干預(yù)誘發(fā)的急慢性并發(fā)癥
　　早在 1994年就有研究者利用胚胎干細(xì)胞同源重組的方法構(gòu)建UOX基因敲除小鼠，在5 思齡OX鼓除小鼠的腎臟中可見(jiàn)大量尿酸結(jié)品以及腎小管急性萎縮，這也是誘發(fā)小綠大量死亡的原因。近年，有研究者通過(guò) TALEN 技術(shù)進(jìn)行雜合子敲除，然后將敲除后的小鼠交配獲得U/OX純合小鼠，這種方法提升了小綠存活率，這些小鼠均表現(xiàn)出顯著的腎功能障礙，其中雄性小鼠伴有顯著性的胰腺損傷以及胰島素分泌受損，而雌性小鼠伴有高血壓以及脂代謝障礙。在UOX敲除的雄性小鼠中，輔以鏈脲霉素飼養(yǎng)可加速胰島β細(xì)胞損傷及誘導(dǎo)糖尿病5。
　　在雜交獲得的系統(tǒng)性 GLUT9基因敲除小鼠中，研究者觀察到腎臟中梗阻性結(jié)石、腎小管間質(zhì)炎癥和皮質(zhì)的進(jìn)行性炎癥纖維化，以及經(jīng)度腎功能不全5!。與此不同的是，在肝臟特異性敲除 GLU/T9 后，里然尿酸水平出現(xiàn)大幅升高，但并無(wú)顯著性的腎臟以及心血管損傷51、5∶在腸上皮細(xì)胞特異性敲除 GLUT9后，機(jī)體出現(xiàn)脂代謝紊亂、血壓升高以及心臟重構(gòu)的現(xiàn)象。另有研究顯示，條件性誘導(dǎo)腎 GLUT9 敲除1周后，收縮壓和舒張壓雙重下降，同時(shí)心率升高。
　　4 展望
　　隨著發(fā)病率的逐年升高∶HUA長(zhǎng)期慢性所伴隨的并發(fā)癥問(wèn)題亦浮出水面。當(dāng)前，大多數(shù)動(dòng)物模型僅用于短期降尿酸修選，關(guān)于其長(zhǎng)期并發(fā)癥甚少。雖然藥物聯(lián)合模型在長(zhǎng)期慢性 HUA中具有良好的表現(xiàn)，但器官損傷也多集中于腎臟，對(duì)其他如心血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)并發(fā)癥鮮有提及。建立合適的長(zhǎng)期藥物造模方法并系統(tǒng)性評(píng)估其對(duì)多種慢性并發(fā)癥的影響，對(duì)今后HUA 相關(guān)研究的發(fā)展具有良好助力。
　　當(dāng)前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要選擇小鼠或大鼠進(jìn)行HUA模型構(gòu)建，而嚙齒類(lèi)動(dòng)物由于表達(dá)尿酸酶并不是最佳的 HUA 模式動(dòng)物，因此，今后研究人員可進(jìn)一步推動(dòng)其他模式動(dòng)物如禽類(lèi)在 HUA 相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。由于飼養(yǎng)便捷且廉價(jià)，斑馬魚(yú)被廣泛用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)，但其在 HUA 上的方法建立尚不成熟，在未來(lái)?xiàng)l件優(yōu)化后或許會(huì)有良好的表現(xiàn)。
　　通過(guò)基因干預(yù)誘導(dǎo) HUA模型是今后重要的發(fā)展方向。在當(dāng)前研究中，UOX 敲除可引起尿酸水平的顯著性升高，然而其死亡率高且子代獲得困難。其次為 GLUT9，尤其是肝特異性敲除GLUT9后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在存活率以及尿酸升高倍數(shù)上均有良好表現(xiàn)。其實(shí)，無(wú)論是何種敲除，均需考慮該基因及尿酸水平對(duì)胚胎發(fā)育的影響，在未來(lái)?xiàng)l件性誘導(dǎo)敲除或許是解決胚胎致畸致死或成年前死亡率過(guò)高的發(fā)展方向。