可注射凝膠材料腫瘤術后疫苗用于結直腸癌免疫治療大鼠動物模型實驗研究
發布時間：
2022-07-20
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大鼠腫瘤動物模型,腫瘤模型,大鼠動物模型,癌癥免疫治療,癌癥疫苗,水凝膠,生物材料,個性化腫瘤疫苗模型,個性化精準治療
簡介
結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）為全球上第三大最普遍的癌癥，其發病率和死亡率在全球不斷上升。除了人口老化及高收入國家的生活飲食外，肥胖、缺乏日常鍛煉及吸煙等不良好因素發生的概率將能夠增加結直腸癌的患病機率。病理生理學的發展提升了一部分及晚期疾病的治療抉擇，加強了個體化治療的發展。結直腸癌的經典治療模式通常為手術、化療及放射療法，這些方法可以用來聯合治療患者。然而，這類治療手段存在著很多的負作用，因為它們針對于正常細胞增長及分裂存在著較大的細胞毒性。此外，許多患者經過多層次治療，依舊會面臨著腫瘤再次復發的風險。所以，尋找高效的替代治療方法對于治療結腸癌患者至關重要。
免疫療法是癌癥治療的新選擇之一。免疫療法的策略是利用病人自身的免疫系統來對抗癌細胞。一些癌癥免疫治療的結果在某些情況下是驚人的，但是一些依賴于患者自身免疫系統狀態的情況病人則并非如此。那些對癌癥免疫治療反應良好的患者有更好的預后和生活質量。癌癥治療正迅速進入免疫治療時代，癌癥疫苗被認為是最有前途的癌癥免疫治療方法。然而，目前抗癌疫苗研究的進展仍然有限和緩慢，部分原因是在確定和獲得腫瘤特異性抗原方面的困難。考慮到在大多數情況下手術是腫瘤治療的首選，我們是否可以直接從切除的腫瘤中提取抗原用于設計個體化的腫瘤疫苗基于可注射凝膠材料的術后疫苗局部免疫療法，成為腫瘤切除術后免疫治療的一種新型策略和途徑，主要包括可注射水凝膠和原位形成的水凝膠等方式。近年來的研究表明，該治療方式具有易于裝載、可降解和控制緩釋特性，表現出重要的治療力。這類部分免疫治療可能夠出現周身抗腫瘤免疫功效，或者達成治療的功效。
對于這一路徑，因此，我們設計了一種基于可注射凝膠的腫瘤疫苗（DCHVax），用于腫瘤手術后的個性化治療。以切除腫瘤的蛋白質為抗原，CpG/聚乙烯亞胺復合物為佐劑，以多臂聚乙二醇（8-arm PEG-NHz）/氧化葡聚糖（ODEX）動態交聯水凝膠為基質。DCHVax的皮下注射原位招募樹突狀細胞，并誘發其強大的腫瘤特異性免疫反應。我們的結果顯示，它能有效地抑制小鼠腫瘤模型術后殘留腫瘤的生長。這種簡單而個性化的癌癥疫苗開發方法有望成為臨床相關的癌癥術后治療方案。
目的
利用外科醫生在結直腸癌手術中直接接觸腫瘤的條件，創建一類對于可注射凝膠的腫瘤疫苗（DCHVax）能夠適用在發展期結直腸癌術后免疫治療，用以處理結直腸癌醫療之后復發的疑惑。
方法
（1）研制空白可注射動態共價水凝膠∶用不等量質量比的8-arm PEG-NH及ODEX交聯，經過醛基和氨基的席夫堿反應（Schiff base reaction）組合成交聯網格的水凝膠，并依次檢測不同類別質量比研制的可注射動態共價水凝膠強度及粘結性，依照檢測成果挑選出最優的質量比
（2）可注射動態共價水凝膠的現狀∶檢測出最好質量比情形之下研制的水凝膠基于體內及體外的溶解情形；
（3）含有模型抗原的動態共價水凝膠疫苗（DCHVax）的制備∶將模型抗原 OVA 以及佐劑（CpG/PEI）擔載到可注射動態共價水凝膠中，并測試其緩釋效果
（4）腫瘤中抗原蛋白的提取當腫瘤體積達到200mm?左右時，從小鼠體內切除 MC38或 CT26腫瘤細胞，制備出抗原，用 BCA 法測定蛋白質抗原的含量，定量備用
（5）動態共價水凝膠疫苗（DCHVax）的制備將佐劑（CpG/PEI）和腫瘤中提取的抗原蛋白擔載到可注射動態共價水凝膠中，并測試其緩釋效果
（6）動態共價水凝膠疫苗（DCHVax）殺滅殘留腫瘤效果的驗證∶構建BALB/c小白鼠和C57BL/6小黑鼠皮下結腸癌CT26、MC38細胞不完全切除腫瘤模型，術中將DCHVax注射到小鼠腋下淋巴結處，檢測同時保存殘留腫瘤增長形式；同時研究注射后第3天及第10天留存的腫瘤免疫細微生長環境的變化；
（7）動態共價水凝膠疫苗（DCHVax）治療之后的腫瘤特殊性免疫記憶效應的檢驗∶皮下未全部根除腫瘤模型里面通過DCHVax 治療的小鼠，檢驗同時記載腫瘤增長形式同時研究系統性免疫細微生存狀態（血液及脾臟）的變化
結果
（1）當8-am PEG-NH與ODEX的質量比為11時，交聯形成的可注射動態共價水凝膠同時存在很強的強度及優異的系統粘結性基于身體外，能夠注射動態共價水凝膠溶解時間是18天基于身體里面，這種溶解時間超過18天；
（2）模型抗原B16-OVA裝載及驗證，CT26/MC38抗原蛋白被成功提取，并與佐劑（CpG/PEI）被成功裝載到可注射動態共價水凝膠中制成腫瘤疫苗DCHVax，并且能夠隨著DCHVax的降解而同步釋放，抗原蛋白和佐劑CpG/PEI的釋放時間均達到18天；
（3）在皮下不完全切除腫瘤模型中，術中將DCHVax注射到小鼠腋下淋巴結處，顯著抑制了腫瘤的再生長。殘留腫瘤免疫微環境分析結果顯示∶在術之后治療第3天，本來存在的免疫被快速激活，自然殺傷細胞（Nature killer cells，NK 細胞）的浸潤提升，樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）的活化顯著提升，之后適應環境性能免疫能夠被激活，腫瘤里面T細胞浸潤數目明顯提升（第6天）
（4）皮下不完全切除腫瘤模型中，搭載OVA模型抗原制備而成的DCHVax-OVA，在對不同分組的B16-OVA小鼠模型進行治療發現，經DCHVax-OVA治療后結果顯示∶血液及脾臟內記憶T細胞數量顯著增多
（5）皮下不完全切除腫瘤模型中，搭載我們從腫瘤組織中提取的MC38模型抗原制備而成的DCHVax-MC38，在對不同分組的MC38 小鼠模型進行治療發現，經DCHVax-MC38治療后監測并記錄腫瘤生長情況全身系統性免疫分析結果顯示∶血液及脾臟內記憶T細胞數量顯著增多
（6）為此我們進行了多種腫瘤模型的驗證，在皮下不完全切除腫瘤模型中，術中將DCHVax-CT26注射到小鼠腋下淋巴結處，同樣顯著抑制了CT26腫瘤的再生長。
結論
在這項研究中，我們提出了一種用于術后腫瘤治療的 DCHVax 個性化癌癥疫苗平臺。我們的研究結果嚴格證實了DCHVax平臺能有效地抑制腫瘤術后復發，顯著延長小鼠存活時間。與目前報道的個性化癌癥疫苗方法相比，這個平臺簡單、高效、經濟有效，而且普遍適用。因此，我們認為DCHVax平臺對于腫瘤術后治療，特別是晚期腫瘤的臨床應用具有重要意義。
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