骨質(zhì)疏松動物建模方法及應用梳理為OP發(fā)病機制探索、藥物篩選、防治手段等研究建模和實驗設(shè)計提供參考

發(fā)布時間：

2022-08-08

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細胞庫源細胞、動物實驗、CRO服務(wù)、SCI潤色)

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骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種常見的全身性骨骼代謝性疾病，可導致骨質(zhì)脆性增加和骨折傾向，危害個人健康，加重社會公共醫(yī)療衛(wèi)生負擔。關(guān)于OP的科學研究離不開OP動物模型的構(gòu)建，目前造模方法主要包括誘導建模和基因工程建模兩類

　　摘要
　　骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種常見的全身性骨骼代謝性疾病，可導致骨質(zhì)脆性增加和骨折傾向，危害個人健康，加重社會公共醫(yī)療衛(wèi)生負擔。關(guān)于OP的科學研究離不開OP動物模型的構(gòu)建，目前造模方法主要包括誘導建模和基因工程建模兩類。
　　誘導建模包括手術(shù)誘導、藥物誘導、飲食誘導、失用性誘導等，常用動物包括大鼠、小鼠、兔、羊、豬、狗、斑馬魚和非人類靈長類動物。
　　基因工程建模則多通過基因編輯技術(shù)將外源性基因插入動物基因組或?qū)游镒陨砘蜻M行突變、敲除、過表達等使得動物具有骨質(zhì)疏松特性，目前常用動物有小鼠和斑馬魚。不同的動物模型和建模方法各具優(yōu)缺點，應綜合考慮具體研究目的和關(guān)鍵科學問題，建立最合適的0P動物模型。
　　筆者主要對目前各種骨質(zhì)疏松動物建模方法及應用進行匯總梳理，以期為日后 OP發(fā)病機制探索、藥物篩選、防治手段等研究建模和實驗設(shè)計提供參考。
　　關(guān)鍵詞
　　骨質(zhì)疏松動物模型,動物模型,動物模型建模方法
　　一、誘導法建立 OP模型
　　誘導建模最常用的手段是去勢法，即通過手術(shù)切除動物的卵巢/睪丸來模擬女性絕經(jīng)后OP或老年男性由于性激素分泌大幅減少而誘發(fā)的老年性O(shè)P。其中，去卵巢大鼠是美國食品和藥品管理局和WHO推薦的研究絕經(jīng)后OP模型。卵巢切除14d 后脛骨近端干骺端有明顯的骨丟失，30、60 d后股骨頸、腰椎體部分別出現(xiàn)顯著的骨丟失口，3月齡大鼠去卵巢后約50d骨重塑達到穩(wěn)定狀態(tài)，即建立可靠的OP模型。
　　糖皮質(zhì)激素誘導的OP是最常見的繼發(fā)性O(shè)P 類型03，服用糖皮質(zhì)激素導致骨形成受損，骨折風險在幾個月內(nèi)以劑量依賴性方式增加。同理，維甲酸可影響骨代謝，激活破骨細胞促進骨吸收，使骨重建處于骨吸收大于骨形成的負平衡狀態(tài)。目前糖皮質(zhì)激素和維甲酸誘導 OP 的研究中，根據(jù)劑量和給藥方式的不同，一般2~6周可成功建模。此外，骨失用亦是導致骨質(zhì)流失和繼發(fā)性O(shè)P的原因之一，故可用懸吊、固定等方式模擬人類運動功能受限或障礙引起的廢用性骨質(zhì)疏松。
　　對目前的誘導建模進行歸納，可以分為手術(shù)誘導（卵巢切除術(shù)、甲狀旁腺切除、松果體切除等）、藥物誘導（如維甲酸、糖皮質(zhì)激素等）、飲食誘導（如低鈣、磷、維生素D飲食等）、失用性誘導（如懸尾、固定等）等，常用動物包括大鼠、小鼠、兔、羊、豬、狗、斑馬魚和非人類靈長類動物。表1總結(jié)了OP常用的誘導建模的動物種類及其優(yōu)缺點比較。比起控制單因素建模，部分研究者認為聯(lián)合去卵巢與糖皮質(zhì)激素等手段建模可以達到更優(yōu)效果*。因此，研究人員必須綜合考慮研究目的和關(guān)鍵科學問題，以及每種模式動物的優(yōu)缺點建立最適合的OP動物模型.
　　二、基因工程法建立OP模型
　　基因工程建模是指通過基因編輯技術(shù)將外源性基因插入動物基因組或?qū)游镒陨砘蜻M行突變、敲除，過表達等使動物具有骨質(zhì)疏松特性，常用動物有小鼠和斑馬魚腳。目前基因工程法建立OP模型仍處于探索階段，部分研究將基因工程技術(shù)與去勢法相結(jié)合，探究目的基因?qū)τ贠P的影響，從而有助于臨床OP新療法的研究；另一部分研究旨在探究目的基因敲除或過表達后對于骨骼系統(tǒng)的影響，從而致力于OP發(fā)病機制的探索。
　　2.1 基因敲除動物模型
　　基因敲除動物模型根據(jù)目標基因缺失的靶細胞不同，又分為全身性基因敲除和條件性基因敲除兩種動物模型.
　　2.1.1 全身性基因敲除動物模型∶Priyatha等的研究結(jié)果指出p21敲除（p21~/）小鼠可以防止去勢法引起的骨丟失，在非臨界大小的頜骨缺損中與野生型對照組相比顯示出增強的骨再生。CD73是一種成骨細胞活化劑和骨骼生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，老螯CD73敲除小鼠骨缺損在骨愈合過程中表現(xiàn)出延遲的骨再生和顯著減少的骨基質(zhì)沉積，且細胞增殖和ALP活性紊亂，骨形成和骨吸收平衡失調(diào)，表明CD73的激活可能是改善老年人群骨再生的潛在機制品。AbrlA1敲除小鼠（AkrlA1KWAW）也表現(xiàn)出骨發(fā)育異常和OP，并推測可能是由骨形成受損引起的OP。此外，通過給予抗壞血酸，AkrlA1敲除小鼠表現(xiàn)出可控制的OP，表明了其作為OP研究的新動物模型的可能夠.
　　鐵紊亂也被證實與OP之間存在某種相關(guān)性，大量研究著眼于此開展.Zhou等級發(fā)現(xiàn)Im2敲除小鼠顯示出骨密度降低、骨小梁質(zhì)量和結(jié)構(gòu)受損，骨鐵缺乏和肝鐵超載，與野生型小鼠相比表現(xiàn)出更為嚴重的OP。Lin等通過鐵轉(zhuǎn)運蛋白1基因（fpn1）突變體Wehtp85c斑馬魚證明了缺鐵可能通過成骨細胞的分化和礦化影響骨形成。姜宇等通過CRISPR/CAS9技術(shù)敲除鐵調(diào)素基因建立了體內(nèi)鐵蓄積的斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)成骨基因表達降低，骨發(fā)育遲緩，骨量減低。Zhang等等。蘇幸國、Yu 等分別通過CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)在斑馬魚中產(chǎn)生了ATP6V1H功能缺失突變體、wmtl6~"突變體、nr3c1~/"突變體，證明了相應目的基因的敲除影響斑馬魚骨骼發(fā)育，為基因工程法建立斑馬魚OP 模型提供了新的思路。
　　2.1.2 條件性基因敲除動物模型∶MK生長因子（促血小板生成素）在調(diào)節(jié)骨骼穩(wěn)態(tài)和造血方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Alvarez等通過刪除Mpl基因編碼外顯子3構(gòu)建了條件敲除小鼠（Mpl"；PF4cre），其中Mpl，主要的MK生長因子受體被特異性敲除，導致了股骨中段的BV/TV顯著增加，骨髓基質(zhì)細胞亦大量增加。毛峰峰回利用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了成骨細胞特異性TGFBR2基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因小鼠早期生長延遲及骨密度、骨體積、骨形成速率明顯降低，血清ALP水平明顯下降，最終發(fā)生低轉(zhuǎn)換率的OP。Wu等一發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶Meml3的條件性敲除會誘導OP的病理學特征·同時他們還構(gòu)建了條件性敲入Menl3的模型小鼠，與去勢的模型鼠相比，Meml3過表達可預防雌激素不足引起的OP。Iee 等目首次報道在小鼠中，單核細胞/巨噬細胞特異性敲除破骨細胞前體中受體相互作用蛋白140 （RIP140）會導致松質(zhì)骨減少，破骨細胞活性增加，成骨細胞活性降低，骨形成減少。
　　2.2 基因過表達動物模型
　　Nancy Karam等發(fā)現(xiàn)過度表達在骨骼和關(guān)節(jié)發(fā)育中十分重要的同源盒轉(zhuǎn)錄因子配對樣同源結(jié)構(gòu)城1（PTX1）的轉(zhuǎn)基因mColla1-Pitx1小鼠會表現(xiàn)出嚴重的老年性O(shè)P表型，其骨量、骨密度和生物力學強度顯著降低，提示其作為老年性O(shè)P動物模型的可能。核因子RB受體活化因子配體（RANKL）在一系列退行性骨疾病的由破骨細胞誘導的骨吸收中起關(guān)鍵作用。在VaglisRinotas等的研究中，他們產(chǎn)生了攜帶人類RANKL基因組區(qū)（huRANKL）的轉(zhuǎn)基因小鼠（TghuRANKL），實現(xiàn)了不同程度的RANKL過表達，同時表達不同量級RANKL的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出有差異的OP。Jochen Schulze等網(wǎng)發(fā)現(xiàn)在成骨細胞中特異性過度表達Krm2的Collal-Krm2轉(zhuǎn)基因小鼠會發(fā)展為嚴重的OP，小梁骨體積和小梁數(shù)量減少，生物力學穩(wěn)定性降低，骨脆性增加，骨形成受損，骨吸收增加。Kiyoshi Hiramatu 等。進行的一項旨在檢測γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）在體內(nèi)致病作用的研究發(fā)現(xiàn)過度表達GGT的轉(zhuǎn)基因小鼠通過加速破骨細胞的生成和骨吸收導致骨質(zhì)減少，并導致OP的形成，亦為OP建模提供了新思路。
　　2.3 其他
　　Yin等以重組腺病毒為載體，將AD-APN-EGFP注射到去勢大鼠股骨遠端前內(nèi)側(cè)表面構(gòu)建的骨缺損處，隨后植入鈦種植體，證實了脂聯(lián)素（APN）的過表達會引起OCN、Rumx2和ALP等成骨標志物表達的明顯升高，且去勢大鼠的骨整合和植入體穩(wěn)定性顯著增加。Liu等Q、Huang等D、Li等9-分別用Ad-Wmt10b、GPNMB（糖蛋白非黑色素瘤克隆B）和骨膜蛋白（Postn）轉(zhuǎn)染的方法，證明了在去勢條件下以上策略能夠在一定程度上促進骨再生，從而可能作為治療OP的潛在手段，為OP骨再生提供了一種新的治療思路。
　　邊麗璇網(wǎng)通過糖皮質(zhì)激素和模擬微重力效應處理斑馬魚早期胚胎建立OP模型，以SalB和AF 作為激活劑上調(diào)Nrf2基因的表達，發(fā)現(xiàn)Nrl2過表達可緩解骨代謝失衡。Lu等等的一項研究使用了shRNA介導的Pax2重組慢病毒（shPax2）轉(zhuǎn)染小鼠致密骨來源的MSC，建立了一個異位骨形成模型。結(jié)果提示Pax2在骨相關(guān)疾病的病理生理學中具有一定的作用，抑制Pax2的功能可能會損害新骨形成。
　　綜上所述，OP動物模型的建立包括誘導建模和基因工程建模.誘導建模常用去勢法和糖皮質(zhì)激素誘導。而基因工程建模目前多為全身性基因敲除動物模型和基因過表達動物模型，條件性基因敲除動物模型以及基因敲入動物模型研究較少。而基因過表達動物模型多與去勢法相結(jié)合，在OP已建立的情況下通過基因過表達手段等進行相應研究。隨著基因編輯技術(shù)的日益完善、基因工程動物模型的培育成熟，OP發(fā)病機制及其相關(guān)信號通路研究將有望為臨床治療和疾病預防提供更多新策略。