動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基問(wèn)題集定為您解決各種困擾！

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2021-12-03

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吉妮歐

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培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，但是最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基也會(huì)給實(shí)驗(yàn)者帶來(lái)了一系列的問(wèn)題。細(xì)胞培養(yǎng)基問(wèn)題匯總

　　動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（animal cell culture）就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞（使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。
　　按照細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展歷史，細(xì)胞培養(yǎng)基大致可分為平衡鹽溶液、天然細(xì)胞培養(yǎng)基、合成細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基、限定化學(xué)成分細(xì)胞培養(yǎng)基等幾大種類。
　　培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，但是最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基也會(huì)給實(shí)驗(yàn)者帶來(lái)了一系列的問(wèn)題。
　　細(xì)胞培養(yǎng)基問(wèn)題匯總
　　1.怎樣查一個(gè)特定細(xì)胞株的相關(guān)知識(shí)和培養(yǎng)條件？
　　ATCC（American Type Culture Collection）收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開(kāi)ATCC細(xì)胞網(wǎng)頁(yè)的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來(lái)源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。
　　2.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？
　　培養(yǎng)某類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣容易生長(zhǎng)。總之，首選MEM、DMEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)；RPMI1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
　　3.自己新配制的液體培養(yǎng)基能保存多久？
　　我們建議將新配制的培養(yǎng)基放置于4℃，避光保存盡量在一周內(nèi)使用完畢，培養(yǎng)基越新鮮越好。

　　4.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎？
　　一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在一到兩周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。
　　5.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
　　除了特殊篩選系統(tǒng)外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
　　為防止細(xì)菌、真菌污染，可以加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液，其培養(yǎng)基中的終濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素為100ug/ml，但是不建議長(zhǎng)期使用。
　　6. 液體培養(yǎng)基可以放-20℃保存嗎？
　　不可以！因?yàn)樵?20℃下，培養(yǎng)基中的鹽容易析出，培養(yǎng)基融化后，有的鹽可能無(wú)法重新溶解，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓降低，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞容易破裂而死亡。
　　7.為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值越來(lái)越偏堿性？
　　培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2，以調(diào)整pH 值。

　　8.為什么液體培養(yǎng)基1640顏色發(fā)黃，是pH值不對(duì)嗎？
　　不是。因?yàn)榕浞皆颍?640為減酚紅型，其中酚紅的濃度只有DMEM的四分之一，所以是因?yàn)榉蛹t濃度低，而非PH值低。
　　9.培養(yǎng)液pH是怎樣影響細(xì)胞生長(zhǎng)的？
　　由于大多數(shù)細(xì)胞適宜PH值為7.2-7.4，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對(duì)PH值要求也不完全相同，原代細(xì)胞培養(yǎng)一般對(duì)PH值變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。
　　但總體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些，偏酸環(huán)境中更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，配制培養(yǎng)用液時(shí)可把液體的PH值稍微調(diào)的偏酸一些。液體在經(jīng)過(guò)0.1um或0.2um濾膜過(guò)濾時(shí)，PH值會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。
　　10.培養(yǎng)液滲透壓是怎樣影響細(xì)胞生長(zhǎng)的？
　　當(dāng)細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的分子濃度不同時(shí)就會(huì)產(chǎn)生滲透壓。這種情況下，水分通過(guò)滲透流入或流出細(xì)胞，從而改變細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境。
　　高滲透壓迫使水分從細(xì)胞中擴(kuò)散出來(lái)導(dǎo)致細(xì)胞收縮，這種情況會(huì)使DNA和蛋白遭到破壞，細(xì)胞周期停滯以及最終使細(xì)胞死亡；反之，低滲透壓使水分流入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞腫脹破裂。

　　11.為什么有客戶要求培養(yǎng)基中不含酚紅？
　　研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加酚紅的培養(yǎng)基。
　　12.酚紅的作用是什么？
　　酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。
　　13.干粉培養(yǎng)基里含NaHCO3嗎？
　　所有的干粉培養(yǎng)基中都不含NaHCO3 。
　　請(qǐng)依據(jù)說(shuō)明書(shū)或包裝袋上的標(biāo)注，在干粉培養(yǎng)基完全溶解后添加NaHCO3 。
　　14.NaHCO3的作用是什么？
　　與CO2一起形成緩沖系統(tǒng)，保持培養(yǎng)基PH值穩(wěn)定。
　　15.我們實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱CO2濃度一直以來(lái)都是5%，這樣可以嗎？
　　當(dāng)然不可以，不同的培養(yǎng)基要求添加NaHCO3的量不一樣，如DMEM要求添加3.7g/L，為了保持PH值穩(wěn)定，必須用高濃度的CO2平衡，一般不低于8%，而1640等要求添加NaHCO3 2.2g/L，還有些培養(yǎng)基要求添加更少，那么這些培養(yǎng)基就要求較低的濃度平衡，一般是5%。
　　16.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
　　丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
　　丙酮酸鈉的貯存液濃度一般為50mM，-20℃保存，培養(yǎng)基中的終濃度為1mM.
　　17.谷氨酰胺的作用是什么？
　　幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源，參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。
　　谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20℃冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4度冰箱儲(chǔ)存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。
　　18.在培養(yǎng)基中加入HEPES有何好處？
　　培養(yǎng)基中最常用的Buffer system是碳酸氫鹽，它可提供營(yíng)養(yǎng)，但卻在生理PH值條件下會(huì)降低緩沖能力。而HEPES是一種很強(qiáng)的Buffer，加入HEPES能使細(xì)胞培養(yǎng)基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強(qiáng)。
　　Hepes的貯存液濃度一般為1M，常溫保存。培養(yǎng)基中的終濃度為25mM，即5ml 1M的Hepes加入到200ml完全培養(yǎng)基中。

　　19.GlutaMAX-Ⅰ是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-Ⅰ？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
　　GlutaMAX-Ⅰ是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的a-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。
　　GlutaMAX-Ⅰ二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20min， GlutaMAX-Ⅰ二肽溶液有最小的降解；而在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
　　L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的，但其在溶液中不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。因此GlutaMAX-Ⅰ是細(xì)胞培養(yǎng)中谷氨酰胺的替代品。
　　20.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
　　不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大多無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。