動物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基問題集定為您解決各種困擾！

發(fā)布時間：

2021-12-03

來源：

吉妮歐

作者：

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培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)中不可缺少的營養(yǎng)成分，但是最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基也會給實驗者帶來了一系列的問題。細胞培養(yǎng)基問題匯總

　　動物細胞培養(yǎng)（animal cell culture）就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞（使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。
　　按照細胞培養(yǎng)基的發(fā)展歷史，細胞培養(yǎng)基大致可分為平衡鹽溶液、天然細胞培養(yǎng)基、合成細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基、限定化學(xué)成分細胞培養(yǎng)基等幾大種類。
　　培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)中不可缺少的營養(yǎng)成分，但是最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基也會給實驗者帶來了一系列的問題。
　　細胞培養(yǎng)基問題匯總
　　1.怎樣查一個特定細胞株的相關(guān)知識和培養(yǎng)條件？
　　ATCC（American Type Culture Collection）收集了絕大多數(shù)細胞的詳細資料。打開ATCC細胞網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC細胞數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻等資料。
　　2.如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？
　　培養(yǎng)某類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣容易生長。總之，首選MEM、DMEM做貼壁細胞培養(yǎng)；RPMI1640做懸浮細胞培養(yǎng)。
　　3.自己新配制的液體培養(yǎng)基能保存多久？
　　我們建議將新配制的培養(yǎng)基放置于4℃，避光保存盡量在一周內(nèi)使用完畢，培養(yǎng)基越新鮮越好。

　　4.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？
　　一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在一到兩周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
　　5.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
　　除了特殊篩選系統(tǒng)外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
　　為防止細菌、真菌污染，可以加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液，其培養(yǎng)基中的終濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素為100ug/ml，但是不建議長期使用。
　　6. 液體培養(yǎng)基可以放-20℃保存嗎？
　　不可以！因為在-20℃下，培養(yǎng)基中的鹽容易析出，培養(yǎng)基融化后，有的鹽可能無法重新溶解，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓降低，培養(yǎng)細胞時，細胞容易破裂而死亡。
　　7.為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值越來越偏堿性？
　　培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2，以調(diào)整pH 值。

　　8.為什么液體培養(yǎng)基1640顏色發(fā)黃，是pH值不對嗎？
　　不是。因為配方原因，1640為減酚紅型，其中酚紅的濃度只有DMEM的四分之一，所以是因為酚紅濃度低，而非PH值低。
　　9.培養(yǎng)液pH是怎樣影響細胞生長的？
　　由于大多數(shù)細胞適宜PH值為7.2-7.4，偏離此范圍對細胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細胞對PH值要求也不完全相同，原代細胞培養(yǎng)一般對PH值變動耐受差，無限細胞系耐受力強。
　　但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環(huán)境中更有利于細胞的生長。因此，配制培養(yǎng)用液時可把液體的PH值稍微調(diào)的偏酸一些。液體在經(jīng)過0.1um或0.2um濾膜過濾時，PH值會向上浮動0.2左右。
　　10.培養(yǎng)液滲透壓是怎樣影響細胞生長的？
　　當細胞內(nèi)、外環(huán)境的分子濃度不同時就會產(chǎn)生滲透壓。這種情況下，水分通過滲透流入或流出細胞，從而改變細胞的內(nèi)環(huán)境。
　　高滲透壓迫使水分從細胞中擴散出來導(dǎo)致細胞收縮，這種情況會使DNA和蛋白遭到破壞，細胞周期停滯以及最終使細胞死亡；反之，低滲透壓使水分流入細胞內(nèi)，使細胞腫脹破裂。

　　11.為什么有客戶要求培養(yǎng)基中不含酚紅？
　　研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，細胞培養(yǎng)，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加酚紅的培養(yǎng)基。
　　12.酚紅的作用是什么？
　　酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。
　　13.干粉培養(yǎng)基里含NaHCO3嗎？
　　所有的干粉培養(yǎng)基中都不含NaHCO3 。
　　請依據(jù)說明書或包裝袋上的標注，在干粉培養(yǎng)基完全溶解后添加NaHCO3 。
　　14.NaHCO3的作用是什么？
　　與CO2一起形成緩沖系統(tǒng)，保持培養(yǎng)基PH值穩(wěn)定。
　　15.我們實驗室培養(yǎng)箱CO2濃度一直以來都是5%，這樣可以嗎？
　　當然不可以，不同的培養(yǎng)基要求添加NaHCO3的量不一樣，如DMEM要求添加3.7g/L，為了保持PH值穩(wěn)定，必須用高濃度的CO2平衡，一般不低于8%，而1640等要求添加NaHCO3 2.2g/L，還有些培養(yǎng)基要求添加更少，那么這些培養(yǎng)基就要求較低的濃度平衡，一般是5%。
　　16.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
　　丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
　　丙酮酸鈉的貯存液濃度一般為50mM，-20℃保存，培養(yǎng)基中的終濃度為1mM.
　　17.谷氨酰胺的作用是什么？
　　幾乎所有的細胞對谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。
　　谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20℃冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4度冰箱儲存兩周以上時，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
　　18.在培養(yǎng)基中加入HEPES有何好處？
　　培養(yǎng)基中最常用的Buffer system是碳酸氫鹽，它可提供營養(yǎng)，但卻在生理PH值條件下會降低緩沖能力。而HEPES是一種很強的Buffer，加入HEPES能使細胞培養(yǎng)基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強。
　　Hepes的貯存液濃度一般為1M，常溫保存。培養(yǎng)基中的終濃度為25mM，即5ml 1M的Hepes加入到200ml完全培養(yǎng)基中。

　　19.GlutaMAX-Ⅰ是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-Ⅰ？這個二肽有多穩(wěn)定？
　　GlutaMAX-Ⅰ是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的a-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。
　　GlutaMAX-Ⅰ二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20min， GlutaMAX-Ⅰ二肽溶液有最小的降解；而在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
　　L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的，但其在溶液中不穩(wěn)定，經(jīng)過一段時間后會降解，確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。因此GlutaMAX-Ⅰ是細胞培養(yǎng)中谷氨酰胺的替代品。
　　20.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
　　不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大多無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活。