教您實(shí)驗(yàn)原理及步驟關(guān)于慢病毒感染細(xì)胞教程詳細(xì)講解

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2021-12-13

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慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞

　　1. 實(shí)驗(yàn)原理
　　慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。
　　所以，在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。
　　2. 主要材料
　　細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-鏈霉素溶液、慢病毒、Polybrene助轉(zhuǎn)染試劑
　　3. 主要試劑配制
　　（1）PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，121℃，30min，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 　　（2）細(xì)胞生長培養(yǎng)液：臨用前根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，再按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
　　4. 實(shí)驗(yàn)步驟
　　（1）胰酶消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5~1×105/ml（根據(jù)情況酌情調(diào)整），每孔200ul細(xì)胞懸液接種至24孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行慢病毒感染，此時(shí)細(xì)胞的融合度約為70%左右。
　　（2）準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬時(shí)離心機(jī)離心20秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)按照MOI準(zhǔn)確計(jì)算慢病毒用量，將其稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。
　　（3）根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)MOI=100進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，準(zhǔn)確計(jì)算好每孔所需病毒原液量。慢病毒使用量=MOI*細(xì)胞數(shù)目/慢病毒滴度，吸取病毒液加入細(xì)胞中，同時(shí)加入5ug/mL的Polybrene助轉(zhuǎn)染試劑，以提高感染效率。
　　注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前，細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。
　　（4）混勻后將24孔板放在37℃度培養(yǎng)箱中孵育。
　　（5）8-12小時(shí)以后觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異，表明慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后更換為新鮮培養(yǎng)基。
　　（6）感染48小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。同時(shí)，收集樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。
　　Lentivirus 表達(dá)時(shí)間較長，但在一般代謝較旺盛的細(xì)胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24h后可以觀察到GFP 熒光；代謝比較緩慢的細(xì)胞（如原代培養(yǎng)細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞等）GFP 蛋白表達(dá)時(shí)間較長，感染后72-96h甚至更長時(shí)間才可以觀察到GFP熒光。感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察GFP的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度來確定Lentivirus 對目的細(xì)胞的感染情況。感染后期請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)換液和傳代，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
　　5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果100X