細(xì)胞培養(yǎng)中的污染及可能的原因有哪些？要如何避免呢？一起來看這個總結(jié)

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2021-12-20

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫源細(xì)胞、動物實驗、CRO服務(wù)、SCI潤色)

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細(xì)胞一旦遭到污染, 所有的實驗結(jié)果都會變得毫無意義。因此, 及時檢測并鑒定出所培養(yǎng)的細(xì)胞是否被污染至關(guān)重要，所以吉妮歐總結(jié)了以下內(nèi)容，和大家一起分享討論

　　如何保持無菌，是每個細(xì)胞（人源細(xì)胞，鼠源細(xì)胞及其它細(xì)胞）培養(yǎng)實驗室一直面對的難題。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術(shù)不嚴(yán)格，試劑質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，大氣中孢子計數(shù)增加，培養(yǎng)箱或操作臺使用和維護(hù)不當(dāng)，污染了的冰箱和水浴鍋。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，操作者不僅要嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，同時還要特別注意新產(chǎn)品、新品牌、以及設(shè)備的清潔維護(hù)。
　　細(xì)胞作為重要的實驗?zāi)Ｐ蛷V泛應(yīng)用于各類生物實驗, 幾乎所有科研實驗室中都需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中最大的威脅就是細(xì)胞污染, 凡是混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中, 對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。細(xì)胞一旦遭到污染, 所有的實驗結(jié)果都會變得毫無意義。因此, 及時檢測并鑒定出所培養(yǎng)的細(xì)胞是否被污染至關(guān)重要，所以吉妮歐總結(jié)了以下內(nèi)容，和大家一起分享討論。
　　常見的污染如下：
　　1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。
　　仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間足夠，壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！
　　可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理。
　　2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長，但時間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差。
　　用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
　　CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個小時，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。
　　其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
　　預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作。
　　3、支原體：黑色的，多為多形，培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染，國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
　　用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。victoryx公司的使用時用50ug/ml DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
　　4、黑膠蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
　　5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
　　6、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時就會影響到細(xì)胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。
　　污染的可能原因：
　　可能原因很多，比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等。
　　關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長就是操作的問題。
　　也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細(xì)胞某項指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結(jié)果。
　　如何避免污染：
　　1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒或者紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水；
　　2、超凈臺\取材\器材\培養(yǎng)液\培養(yǎng)瓶\操作等因素；
　　3、超凈臺的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到6-8格，否則也可能能致霉菌污染；
　　4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進(jìn)入操作。