保存細(xì)胞的復(fù)蘇凍存方法，凍存和復(fù)蘇的原則這些要點(diǎn)你清楚嗎？
發(fā)布時(shí)間：
2021-12-21
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細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化，特別是當(dāng)你采購(gòu)的ATCC細(xì)胞如：人源細(xì)胞，鼠源細(xì)胞時(shí)，如果保存不妥當(dāng)，將會(huì)對(duì)你的項(xiàng)目及成本造成極大的影響。
一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1、標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)， 1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。
2、簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線(xiàn)繩，通過(guò)線(xiàn)繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜，次晨投人液氮中。
3、傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用
在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
四、細(xì)胞凍存方法
1、預(yù)先配制凍存液
10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉海?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml）
3、加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存
五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
1、快速解凍
凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3 分鐘）。
2、解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
3、如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感
解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
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