原代海馬神經元細胞培養常規的試劑配制及試驗操作過程分享
發布時間：
2022-01-13
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一、常規的試劑配制：
1、培養基：選用高糖型DMEM/F12 (1:1)培養基干粉（含15 mmol Hepes），每升培養液中加入碳酸氫鈉1.8 g，調節pH值7.0，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后，加入谷氨酰胺、無菌的青霉素和鏈霉素液，使其終濃度分別為0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分裝后置于4℃保存，臨用前加入2%的B27。神經細胞代謝旺盛，選用高糖型培養基；谷胱甘肽可保持培養基還原狀態，營養成分穩定；B27是公認的刺激神經元生長的營養因子，不過價格挺貴；PH值很關鍵，Hepes是優秀的緩沖系統，pH值調好后能保持很長時間；
2、多聚賴氨酸溶液的配制： 稱取1.5 mg L-多聚賴氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，密封后置于4 ℃保存，可長期使用；
3、磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制： 稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4?12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，調節pH值為7.2，補dd H2O至1000 ml并分裝，高壓滅菌（121～126 ℃），4 ℃備用；
4、D-Hanks液的配制：稱取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4?12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，調節PH值為7.2，定容至1000 ml，高壓蒸汽滅菌（121～126 ℃），4℃備用；
5、0.25%胰蛋白酶的配制：稱取0.25 g胰蛋白酶粉末，少許D-Hanks溶液調成糊狀，用D-Hanks定容至100 ml，混勻，冰箱內放置過夜，濾紙過濾后，0.22 mm微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃保存。
二、試驗操作過程：
1、包被：培養前晚上將培養瓶（板）用多聚賴氨酸包被10 min，吸除，無菌操作臺上15min自然晾干，置于培養箱中備用；
2、取腦：選取新生24 h的SD大鼠數只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮、顱骨，用彎鑷拉開腦區視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數次；（預先準備至少4把眼科剪刀，分別用于斷頭、剪頭皮和剪顱骨及第3步的剪組織這4個操作）
3、分離：以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細剔除微血管，用充分剪碎組織；
4、消化：加入同體積0.125%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，37 ℃培養箱內消化20 min左右，期間輕搖數次；
過濾：加入數滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細胞數分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動作要輕柔，用150目網篩過濾，收集細胞懸液；
5、接種：以1100 rpm離心5 min，傾去上清，用DMEM/F12培養液重懸細胞，輕輕吹打，臺盼藍染色快速計數，根據計數結果，調整細胞終濃度為1 00000個/ml，加入終濃度為10%胎牛血清后接種于培養瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養；12小時內禁止晃動
6、換液：接種后24 h將培養液全量換成無血清DMEM/F12培養液，第48 h時加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經元細胞的過度生長，隨后每3 d半量換液。
此外，原代培養的HT22小鼠海馬神經元細胞系組織由多種細胞構成，如成纖維細胞、膠質細胞等，成分復雜，因此原代培養過程中細胞純化是關鍵的一步。本人主要采取以下措施來達到細胞純化：
?。?）海馬組織取材時組織定位準確，由于海馬游離于大腦皮層，這一點容易做到；
?。?）消化前，細心剔除微血管；
?。?）過濾時選擇150-200目篩網，盡量使培養的細胞呈單個或數個成團；
?。?）接種24 h時需全量換培養基，除去未貼壁的死細胞；
（5）接種48 h時加一定濃度的阿糖胞苷，以抑制非神經元細胞（膠質細胞和少許成纖維細胞）的過度生長。
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