原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)的試劑配制及試驗(yàn)操作過(guò)程分享

發(fā)布時(shí)間：

2022-01-13

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原代培養(yǎng)的海馬組織由多種細(xì)胞構(gòu)成，如成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等，成分復(fù)雜，因此原代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞純化是關(guān)鍵的一步。本人主要采取以下措施來(lái)達(dá)到細(xì)胞純化

　　一、常規(guī)的試劑配制：
　　1、培養(yǎng)基：選用高糖型DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)基干粉（含15 mmol Hepes），每升培養(yǎng)液中加入碳酸氫鈉1.8 g，調(diào)節(jié)pH值7.0，0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，加入谷氨酰胺、無(wú)菌的青霉素和鏈霉素液，使其終濃度分別為0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分裝后置于4℃保存，臨用前加入2%的B27。神經(jīng)細(xì)胞代謝旺盛，選用高糖型培養(yǎng)基；谷胱甘肽可保持培養(yǎng)基還原狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定；B27是公認(rèn)的刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)因子，不過(guò)價(jià)格挺貴；PH值很關(guān)鍵，Hepes是優(yōu)秀的緩沖系統(tǒng)，pH值調(diào)好后能保持很長(zhǎng)時(shí)間；
　　2、多聚賴氨酸溶液的配制：稱取1.5 mg L-多聚賴氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，密封后置于4 ℃保存，可長(zhǎng)期使用；
　　3、磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4?12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，調(diào)節(jié)pH值為7.2，補(bǔ)dd H2O至1000 ml并分裝，高壓滅菌（121～126 ℃），4 ℃?zhèn)溆茫?br /> 　　4、D-Hanks液的配制：稱取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4?12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，調(diào)節(jié)PH值為7.2，定容至1000 ml，高壓蒸汽滅菌（121～126 ℃），4℃?zhèn)溆茫?br /> 　　5、0.25%胰蛋白酶的配制：稱取0.25 g胰蛋白酶粉末，少許D-Hanks溶液調(diào)成糊狀，用D-Hanks定容至100 ml，混勻，冰箱內(nèi)放置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾后，0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾，分裝，-20 ℃保存。
　　二、試驗(yàn)操作過(guò)程：
　　1、包被：培養(yǎng)前晚上將培養(yǎng)瓶（板）用多聚賴氨酸包被10 min，吸除，無(wú)菌操作臺(tái)上15min自然晾干，置于培養(yǎng)箱中備用；
　　2、取腦：選取新生24 h的SD大鼠數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無(wú)菌條件下分層剪開(kāi)頭皮、顱骨，用彎鑷?yán)_(kāi)腦區(qū)視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數(shù)次；（預(yù)先準(zhǔn)備至少4把眼科剪刀，分別用于斷頭、剪頭皮和剪顱骨及第3步的剪組織這4個(gè)操作）
　　3、分離：以腦中線為起點(diǎn)，小心撥開(kāi)大腦顳葉皮層，暴露出新月?tīng)詈ｑR回，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細(xì)剔除微血管，用充分剪碎組織；
　　4、消化：加入同體積0.125%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min左右，期間輕搖數(shù)次；
　　過(guò)濾：加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動(dòng)作要輕柔，用150目網(wǎng)篩過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液；
　　5、接種：以1100 rpm離心5 min，傾去上清，用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打，臺(tái)盼藍(lán)染色快速計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1 00000個(gè)/ml，加入終濃度為10%胎牛血清后接種于培養(yǎng)瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12小時(shí)內(nèi)禁止晃動(dòng)
　　6、換液：接種后24 h將培養(yǎng)液全量換成無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，第48 h時(shí)加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，隨后每3 d半量換液。
　　此外，原代培養(yǎng)的HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系組織由多種細(xì)胞構(gòu)成，如成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等，成分復(fù)雜，因此原代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞純化是關(guān)鍵的一步。本人主要采取以下措施來(lái)達(dá)到細(xì)胞純化：
　　（1）海馬組織取材時(shí)組織定位準(zhǔn)確，由于海馬游離于大腦皮層，這一點(diǎn)容易做到；
　　（2）消化前，細(xì)心剔除微血管；
　　（3）過(guò)濾時(shí)選擇150-200目篩網(wǎng)，盡量使培養(yǎng)的細(xì)胞呈單個(gè)或數(shù)個(gè)成團(tuán)；
　　（4）接種24 h時(shí)需全量換培養(yǎng)基，除去未貼壁的死細(xì)胞；
　　（5）接種48 h時(shí)加一定濃度的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞（膠質(zhì)細(xì)胞和少許成纖維細(xì)胞）的過(guò)度生長(zhǎng)。