小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDC）詳細(xì)到第個(gè)步驟注意事項(xiàng)，請(qǐng)收下

發(fā)布時(shí)間：

2022-02-11

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取小鼠股骨脛骨，小鼠要年輕！（6W-8W，以前用只一年左右的養(yǎng)出來(lái)外形也張牙舞爪，但流式檢測(cè)沒(méi)有CD11c表達(dá)，很奇怪啊；性別方面公母不限，經(jīng)典版本說(shuō)公的好，公的壯實(shí)，骨頭大）

　　1. 取小鼠股骨脛骨，小鼠要年輕！（6W-8W，以前用只一年左右的養(yǎng)出來(lái)外形也張牙舞爪，但流式檢測(cè)沒(méi)有CD11c表達(dá)，很奇怪啊；性別方面公母不限，經(jīng)典版本說(shuō)公的好，公的壯實(shí)，骨頭大）。
　　2. 沖骨髓細(xì)胞，沖出來(lái)的骨髓細(xì)胞永遠(yuǎn)沒(méi)有文獻(xiàn)上說(shuō)的那樣多，但不影響大局，一次用兩只，怕出意外少了細(xì)胞，不要混一起。
　　3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，不去紅細(xì)胞！（不知是好是壞，文獻(xiàn)說(shuō)去紅細(xì)胞會(huì)把一些祖細(xì)胞也去掉了）記數(shù)，計(jì)數(shù)只記白細(xì)胞（形態(tài)學(xué)區(qū)分，紅細(xì)胞無(wú)核較小），2×10e6（似乎太低，這套方案作者是一皿養(yǎng)到第12天的，所以個(gè)人覺(jué)得看在哪天收細(xì)胞做下游實(shí)驗(yàn)，如果只養(yǎng)到第6天或者第8天，多點(diǎn)應(yīng)該也行吧？）白細(xì)胞種100 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿（注意是細(xì)菌培養(yǎng)皿，說(shuō)懸浮細(xì)胞還是用細(xì)菌皿好，還說(shuō)抑制細(xì)胞貼壁，讓更多祖細(xì)胞向樹(shù)突細(xì)胞分化而不是巨噬細(xì)胞），這一天記為第0天。
　　4. 第3天加等體積（10 ml）BMDC培養(yǎng)基
　　配方：每50 ml含：1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基45 ml，5 ml滅活胎牛血清，50 ul 100×的β-巰基乙醇（一直不知道它的作用，請(qǐng)高手跳出來(lái)作答謝謝啊），500 ul 100×的谷氨酸鹽，1 ug rmGM-CSF（Chemicon和PPT的都用過(guò)，現(xiàn)在用PPT，好像還行）。
　　5. 第6天，第8天半量換液，離心設(shè)置為300 g，5min（不知道夠不夠，肯定有損失）。
　　6. 第10天300 g，5min收集懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)到細(xì)胞培養(yǎng)皿（巨噬細(xì)胞多貼點(diǎn)壁），同時(shí)培養(yǎng)基成分里rmGM-CSF含量至少減半。
　　7. 第11天加LPS刺激其成熟，普遍認(rèn)為，第6天或第8天收不成熟DC會(huì)比較多，看實(shí)驗(yàn)需要，建議想要不成熟DC的朋友請(qǐng)?jiān)谶@兩天收網(wǎng)。
　　一般做到第5步就上流式，也就是6到8天的BMDC, CD11c表達(dá)波動(dòng)在50－80％，偶爾做CD86，成熟標(biāo)志吧？15％左右。具體流式結(jié)果和光鏡形態(tài)照片過(guò)幾天（或幾周）發(fā)上來(lái)大家一起探討。MHC2沒(méi)有做（技術(shù)員說(shuō)實(shí)驗(yàn)室流式機(jī)器做APC的有關(guān)部件有故障，MHC2抗體正好帶APC）。還發(fā)現(xiàn)用PE標(biāo)記和FITC標(biāo)記的CD11c流式抗體檢測(cè)CD11c表達(dá)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（還是表達(dá)量）相差1倍（同一批細(xì)胞分兩管，分開(kāi)操作，抗體劑量不同，都過(guò)量了，都洗了兩遍，一個(gè)公司的抗體，25％和50％）。
　　總結(jié)：
　　1. 培養(yǎng)100％純的DC幾乎是不可能，一般達(dá)到85％就不錯(cuò)了，在收集細(xì)胞是只要吹打不要太猛，巨噬細(xì)胞一般是不會(huì)懸浮起來(lái)的。
　　2. 有時(shí)也幾只小鼠的骨髓細(xì)胞混養(yǎng)，但只要是同系（如：都是C57）的，問(wèn)題不大。
　　3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓細(xì)胞混養(yǎng)就不可避免地產(chǎn)生混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。
　　4. 骨髓細(xì)胞中有淋巴細(xì)胞，兩個(gè)個(gè)體的細(xì)胞混合會(huì)產(chǎn)生“混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)”反應(yīng)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞大量增殖