小鼠骨髓來源樹突狀細胞（BMDC）詳細到第個步驟注意事項，請收下

發(fā)布時間：

2022-02-11

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取小鼠股骨脛骨，小鼠要年輕?。?W-8W，以前用只一年左右的養(yǎng)出來外形也張牙舞爪，但流式檢測沒有CD11c表達，很奇怪??；性別方面公母不限，經(jīng)典版本說公的好，公的壯實，骨頭大）

　　1. 取小鼠股骨脛骨，小鼠要年輕！（6W-8W，以前用只一年左右的養(yǎng)出來外形也張牙舞爪，但流式檢測沒有CD11c表達，很奇怪??；性別方面公母不限，經(jīng)典版本說公的好，公的壯實，骨頭大）。
　　2. 沖骨髓細胞，沖出來的骨髓細胞永遠沒有文獻上說的那樣多，但不影響大局，一次用兩只，怕出意外少了細胞，不要混一起。
　　3. 細胞計數(shù)，不去紅細胞?。ú恢呛檬菈?，文獻說去紅細胞會把一些祖細胞也去掉了）記數(shù)，計數(shù)只記白細胞（形態(tài)學區(qū)分，紅細胞無核較?。?，2×10e6（似乎太低，這套方案作者是一皿養(yǎng)到第12天的，所以個人覺得看在哪天收細胞做下游實驗，如果只養(yǎng)到第6天或者第8天，多點應(yīng)該也行吧？）白細胞種100 mm細菌培養(yǎng)皿（注意是細菌培養(yǎng)皿，說懸浮細胞還是用細菌皿好，還說抑制細胞貼壁，讓更多祖細胞向樹突細胞分化而不是巨噬細胞），這一天記為第0天。
　　4. 第3天加等體積（10 ml）BMDC培養(yǎng)基
　　配方：每50 ml含：1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基45 ml，5 ml滅活胎牛血清，50 ul 100×的β-巰基乙醇（一直不知道它的作用，請高手跳出來作答謝謝?。?，500 ul 100×的谷氨酸鹽，1 ug rmGM-CSF（Chemicon和PPT的都用過，現(xiàn)在用PPT，好像還行）。
　　5. 第6天，第8天半量換液，離心設(shè)置為300 g，5min（不知道夠不夠，肯定有損失）。
　　6. 第10天300 g，5min收集懸浮細胞轉(zhuǎn)到細胞培養(yǎng)皿（巨噬細胞多貼點壁），同時培養(yǎng)基成分里rmGM-CSF含量至少減半。
　　7. 第11天加LPS刺激其成熟，普遍認為，第6天或第8天收不成熟DC會比較多，看實驗需要，建議想要不成熟DC的朋友請在這兩天收網(wǎng)。
　　一般做到第5步就上流式，也就是6到8天的BMDC, CD11c表達波動在50－80％，偶爾做CD86，成熟標志吧？15％左右。具體流式結(jié)果和光鏡形態(tài)照片過幾天（或幾周）發(fā)上來大家一起探討。MHC2沒有做（技術(shù)員說實驗室流式機器做APC的有關(guān)部件有故障，MHC2抗體正好帶APC）。還發(fā)現(xiàn)用PE標記和FITC標記的CD11c流式抗體檢測CD11c表達發(fā)現(xiàn)陽性細胞數(shù)（還是表達量）相差1倍（同一批細胞分兩管，分開操作，抗體劑量不同，都過量了，都洗了兩遍，一個公司的抗體，25％和50％）。
　　總結(jié)：
　　1. 培養(yǎng)100％純的DC幾乎是不可能，一般達到85％就不錯了，在收集細胞是只要吹打不要太猛，巨噬細胞一般是不會懸浮起來的。
　　2. 有時也幾只小鼠的骨髓細胞混養(yǎng)，但只要是同系（如：都是C57）的，問題不大。
　　3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓細胞混養(yǎng)就不可避免地產(chǎn)生混合淋巴細胞培養(yǎng)。
　　4. 骨髓細胞中有淋巴細胞，兩個個體的細胞混合會產(chǎn)生“混合淋巴細胞培養(yǎng)”反應(yīng)，導(dǎo)致淋巴細胞大量增殖