四種動(dòng)物建模方案為臨床治療和研究抗癌藥物提供有益方向

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2022-02-22

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肝癌動(dòng)物模型各有特點(diǎn)，不同物種，不同建模方法，可以形成不同病理特點(diǎn)和生物特性，應(yīng)依據(jù)實(shí)際需要選用合適模型

　　常用動(dòng)物模型的建模方案（推薦閱讀：動(dòng)物模型）
　　1.1 自發(fā)型肝癌模型
　　自發(fā)性肝癌模型是指模型動(dòng)物在人工創(chuàng)造的環(huán)境條件下，沒(méi)有經(jīng)過(guò)人工處置而自發(fā)性發(fā)作的腫瘤，這種模型最大的優(yōu)點(diǎn)就是排除了人為因素的干擾，較好還原了動(dòng)物模型在自然條件下的發(fā)病情況[29]。自發(fā)型肝癌模型的發(fā)病時(shí)間與動(dòng)物品系、性別、飼養(yǎng)方式等因素有關(guān)，目前主要用來(lái)反映動(dòng)物的腫瘤易感性、致癌物質(zhì)和環(huán)境因素對(duì)肝癌的影響。不過(guò)因此類模型的腫瘤發(fā)生率低，即使發(fā)生肝癌，腫瘤(大小、數(shù)目和部位等)和模型動(dòng)物(性別、體質(zhì)量和腫瘤發(fā)生時(shí)間等)都存在很大差異，在臨床病理研究與抗藥研究中數(shù)據(jù)不可控，離散度較大，所以自發(fā)型肝癌模型在現(xiàn)代的動(dòng)物造模中較少使用。
　　1.2 誘發(fā)型肝癌動(dòng)物模型
　　誘發(fā)型肝癌模型是指使用誘癌因素在實(shí)驗(yàn)條件下誘使動(dòng)物發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型。由于這類模型的誘發(fā)因素和條件是人為可控的，誘發(fā)腫瘤的成功率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然發(fā)病率，所以是建模的常用手段之一[30]。誘發(fā)型肝癌模型有建模周期長(zhǎng)、成本低、造模成功率高的特點(diǎn)，常用小鼠、大鼠和樹(shù)鼩作為造模對(duì)象，能夠能準(zhǔn)確反映癌癥生物特性和行為，充分模擬人類腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境，是現(xiàn)階段常用的肝癌動(dòng)物模型[31]。目前常用的誘發(fā)型建模方法主要有以下幾種類型。
　　1.2.1 DEN誘導(dǎo)
　　DEN是目前常用的誘癌劑，其主要原理是DEN對(duì)肝臟有特定的毒性，使肝細(xì)胞大面積壞死，最終誘導(dǎo)PHC的發(fā)生[32]。其致癌有以下特點(diǎn)：(1)操作方便，多采用注射器腹腔注射的形式給藥；(2)誘癌成功率高，小劑量、多次給藥便可誘發(fā)肝癌；(3)對(duì)嚙齒類動(dòng)物誘導(dǎo)肝臟病變具有穩(wěn)定性，可模擬肝損傷-肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生過(guò)程[33]。如Chen等[34]用C57BL/6雄性小鼠[6~10周，(22±2)g]，每周0.014% DEN灌胃6 d，第7天正常飲水間隔1 d，持續(xù)15周，第16周檢測(cè)小鼠全部造模成功；Seydi等[35]用DEN聯(lián)合2-乙酰氨基芴的方式對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行肝癌造模，經(jīng)過(guò)15周的造模周期，通過(guò)組織病理學(xué)檢查、肝損傷標(biāo)志物及AFP等指標(biāo)證實(shí)造模成功。
　　1.2.2 CCl4誘導(dǎo)
　　CCl4是一種肝臟的毒性物質(zhì)，其主要原理是通過(guò)反復(fù)急性肝損傷、炎癥和修復(fù)導(dǎo)致纖維化，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌[36]。運(yùn)用CCl4造模有以下特點(diǎn)：(1)腹腔注射的濃度與頻率會(huì)影響其作用部位及毒性，高濃度的CCl4首先損傷的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其次再累及肝、腎；而低濃度長(zhǎng)期注射則主要損傷肝、腎功能[37]；(2)模型穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好；(3)乙醇可以促進(jìn)CCl4的吸收，加重中毒癥狀，所以目前大多選用CCl4與DEN和/或乙醇聯(lián)合使用誘導(dǎo)肝癌發(fā)生，來(lái)減少造模周期，提高造模穩(wěn)定性[38-39]，如Brol等[40]在小鼠體內(nèi)用CCl4和乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)7周后，肝臟炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，伴有明顯的肝纖維化和中度脂肪變性。另外停止注射CCl4后模型動(dòng)物具有自愈性，因此在造模過(guò)程中不能間斷CCl4刺激[41]。CCl4揮發(fā)性強(qiáng)，在操作過(guò)程中要有必要的安全防護(hù)，同時(shí)也要注意密封保存，防止揮發(fā)，影響濃度。
　　1.2.3 其他化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)
　　AFB是由曲霉屬真菌產(chǎn)生的一種雙呋喃環(huán)類毒素。AFB有強(qiáng)烈的致癌性，不過(guò)因其毒性強(qiáng)，劑量不易控制，對(duì)不同鼠類的易感性不同等缺點(diǎn)，現(xiàn)代動(dòng)物造模中常把AFB飲食作為輔助造模方法使用[42]；硫代乙酰胺(TAA)是一種化學(xué)致癌物，TAA進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可引起肝細(xì)胞壞死和肝纖維化，同時(shí)易產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素血癥，使肝臟功能進(jìn)一步惡化，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[43]，如Helmy等[44]用TAA誘導(dǎo)雄性SD大鼠16周，構(gòu)建肝癌大鼠模型；苯巴比妥與二甲氨基偶氮苯作為一種肝臟致癌物，聯(lián)合使用也可以誘發(fā)肝癌，如Pathak等[45]用苯巴比妥聯(lián)合二甲氨基偶氮苯對(duì)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期喂食，在第120天時(shí)處死大鼠，檢測(cè)肝臟組織，發(fā)現(xiàn)大鼠全部發(fā)生肝癌，造模成功率為100%。
　　1.3 移植型肝癌動(dòng)物模型
　　移植型動(dòng)物肝癌模型是指把腫瘤組織、細(xì)胞株移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的荷瘤動(dòng)物模型。這類模型造模成功率高，常在裸鼠、小鼠、大鼠與家兔等動(dòng)物用皮下移植、腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等方式來(lái)構(gòu)建模型。此類造模方法根據(jù)瘤株來(lái)源分為同種移植與異種移植。
　　1.3.1 同種移植模型
　　最早開(kāi)始使用的移植型動(dòng)物肝癌模型是同種移植模型，即同一種屬之間瘤株移植種植。因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物存在近交系、遠(yuǎn)交系之分，即使是同一品系中的不同動(dòng)物也存在遺傳基因的差異性，因此在構(gòu)建模型時(shí)具體分為：(1)自體移植；(2)同種同基因移植(同卵孿生或近交系動(dòng)物之間的移植)；(3)同種異基因移植(同一物種內(nèi)，遺傳結(jié)構(gòu)不同的個(gè)體之間的移植)等3種構(gòu)建方式，免疫排斥反應(yīng)是造模成功與否的關(guān)鍵，其中前兩種移植方法不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，另外裸鼠也可以避免免疫排斥的發(fā)生。如Hepa1-6細(xì)胞株是從小鼠肝癌細(xì)胞中分離得到的，Duan等[46]用Hepa1-6細(xì)胞懸液對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行皮下注射的方式進(jìn)行肝癌造模。
　　1.3.2 異種移植模型
　　異種移植肝癌模型是將不同種屬來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上而建立的模型。異種移植肝癌模型也分為以下2種。(1)異位移植: 即把荷瘤生物的腫瘤細(xì)胞或組織移植于模型動(dòng)物的腋窩、背部皮下等部位，這類方法有成瘤時(shí)間快、造模周期短、瘤體觀察方便的優(yōu)點(diǎn)，常用于篩選抗癌新藥的優(yōu)點(diǎn)。不過(guò)這種方法沒(méi)有體現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，因此異位模型所獲得的治療結(jié)果可能有偏差。(2)原位移植：即把荷瘤生物的腫瘤細(xì)胞或組織移植到動(dòng)物模型的肝臟上，這類模型的優(yōu)點(diǎn)是可以在體內(nèi)較好的模擬腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境，常用于篩選抗癌藥物，易于判斷療效，另外該模型可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，對(duì)不同種類、不同部位進(jìn)行特定移植，如Xu等[47]用人肝癌細(xì)胞株HCC LM3在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建原位肝癌移植模型，并在4周后進(jìn)行超聲等影像學(xué)檢查, 發(fā)現(xiàn)小鼠原位腫瘤移植成功率為90%(18/20只)。
　　1.4 轉(zhuǎn)基因(基因修飾)型肝癌動(dòng)物模型
　　轉(zhuǎn)基因型動(dòng)物模型是指把非自身的誘癌或致癌基因通過(guò)生信技術(shù)導(dǎo)入或整合到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基因染色體中并發(fā)揮功能的一類動(dòng)物模型，近幾年隨著Crispr-Cas9技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，大大提高了精確基因組編輯的準(zhǔn)確率[48]。用Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因型肝癌動(dòng)物模型，有肝癌發(fā)病率高，動(dòng)物模型穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，是目前動(dòng)物模型的研究熱點(diǎn)[49]。
　　目前常用的主要包括以下幾種：(1)用豬來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，因豬體型大，在解剖、生理、代謝、免疫和遺傳學(xué)等方面與人類相似，是發(fā)展大型動(dòng)物癌癥模型的理想模式，如Gaba等[50]通過(guò)Cre重組酶誘導(dǎo)雜合KRASG12D和TP53R167H轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，形成定點(diǎn)和細(xì)胞特異性腫瘤，即Oncopig癌癥模型，此類模型有與人類肝癌相似的細(xì)胞周期、AFP的產(chǎn)生、化學(xué)敏感性和藥物代謝酶的表達(dá)等特點(diǎn)；(2)用小鼠來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，如Hassan等[51]通過(guò)將純合金屬硫蛋白/TGFα和白蛋白/c-myc單轉(zhuǎn)基因小鼠在CD13B6CBA背景下雜交獲得c-myc/TGFα雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并在后代中挑選雄性小鼠，以飲用水中添加鋅加速肝癌發(fā)生的方式來(lái)構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型；FRG小鼠是人源化肝臟研究領(lǐng)域最重要的模型，Stone等[52]Crispr-Cas9技術(shù)編輯腺病毒(AAV)結(jié)合HBV載體(AAV-HBV)，構(gòu)建HBV過(guò)表達(dá)病毒，通過(guò)尾靜脈注射的形式，對(duì)FRG小鼠進(jìn)行肝癌造模。(3)用斑馬魚(yú)來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，斑馬魚(yú)有體積小、繁殖發(fā)育快、肝臟再生能力強(qiáng)、基因序列與人類基因序列高度相似等特點(diǎn)，在肝癌動(dòng)物模型的構(gòu)建中經(jīng)常選用[53]，如Chen等[54]以Tg[fabp10∶ rtTA2s-M2; TRE2∶ EGFP-kras(G12V)]轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^(guò)多西環(huán)素喂養(yǎng)引發(fā)肝癌的方式來(lái)構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型。