基于類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞篩選抗RA物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究具有重要的科學(xué)價(jià)值及社會效益

發(fā)布時(shí)間：

2022-03-18

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類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, ?RA)是一種全球性、自身免疫慢性疾病，危害極大，但安全有效的防治藥物極其醫(yī)乏。環(huán)氧化酶一2 ( COX-2在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，是RA藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶酶。此外，人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞是RA新藥研發(fā)的關(guān)鍵靶細(xì)胞

　　摘要
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種全球性、自身免疫慢性疾病，危害極大，但安全有效的防治藥物極其醫(yī)乏。環(huán)氧化酶一2 ( COX-2在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，是RA藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶酶。此外，人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞是RA新藥研發(fā)的關(guān)鍵靶細(xì)胞。(推薦閱讀：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞)
　　RA屬舍醫(yī)“痹癥”、“外風(fēng)”范疇，為“寒”性疾病。故舍醫(yī)基于“寒者熱之，熱者寒之”的基本治療法則及“扶正祛邪”理念，采用祛風(fēng)除濕類“陽藥”進(jìn)行RA的治療。樹參為五加科樹參屬植物樹參Dendropanax dentiger (Harms)Merr.的根，藥用歷史悠久，是浙江、江西等省區(qū)舍醫(yī)使用頻率較高的30種舍藥之一，屬“陽藥”，具有祛風(fēng)除濕的功效，主要用于治療RA，但其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制仍不清楚。此外，親和超濾偶聯(lián)色譜一質(zhì)譜(AUF-LC-MS)技術(shù)可用于快速篩選中草藥抗RA的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，基于COX-2禍聯(lián)AUF-LC-MS技術(shù)以及細(xì)胞快速篩選樹參根中抗RA的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究具有重要的科學(xué)價(jià)值及社會效益。
　　本研究論文采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)RA C adjuvant-induced arthritis, AIA)大鼠模型、COX-2, AUF-LC-MS, 細(xì)胞、Western blot等技術(shù)，對樹參根抗RA的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

　　具體研究結(jié)果如下:
　　C1)樹參根對AIA動物模型大鼠具有很好的抗RA作用。采用AIA模型大鼠，以模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)、體重、免疫器官指數(shù)、足踩關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查及關(guān)鍵性炎癥因子的變化為依據(jù)，考察樹參根乙醇提取物(低劑量為1 g/kg、中劑量為2 g/kg、高劑量為4 g/kg的生藥劑量，下同)抗RA的作用。結(jié)果表明，樹參根乙醇提取物的高和中劑量能顯著性降低模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)、胸腺和脾臟指數(shù)，提高模型大鼠的體重及改善模型大鼠足踩關(guān)節(jié)病理損傷。此外，樹參根乙醇提取物的高和中劑量能明顯地降低模型大鼠血清中大鼠類風(fēng)濕因子CRF), C反應(yīng)蛋白(CRP、腫瘤壞死因子a C TNF-a、白介素1p(IL-1p)、IL-6和IL,-17的水平，提高血清中IL-4和IL-10的水平，同時(shí)降低外周血液單核細(xì)胞中COX-2, _5一月旨氧合酶(_5-LOX)和基質(zhì)金屬蛋白酶一2 C MMP-2的水平。這些研究結(jié)果表明，樹參根通過抑制炎癥風(fēng)暴因子的惡性循環(huán)，有效的阻斷炎癥反應(yīng)，阻抑免疫器官的異常免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)抗RA的作用。
　　(2)樹參根具有結(jié)構(gòu)類型多樣的化學(xué)成分。
　　采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下，從樹參根乙醇提取物中快速鑒定了81個(gè)化學(xué)成分，包括18個(gè)苯丙素類、1 _5個(gè)生物堿類、14個(gè)黃酮類、14個(gè)脂肪酸類、6個(gè)苯酚類、4個(gè)昌體類、4個(gè)環(huán)膚類、4個(gè)菇類和2個(gè)其他類化合物。其中，78個(gè)化學(xué)成分為首次從樹參植物中報(bào)道，極大的豐富了樹參的化學(xué)成分，為后續(xù)深入研究樹參根的化學(xué)成分奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　(3)樹參根中的C OX-2抑制劑具有重要的篩選價(jià)值。
　　采用COX-2試劑盒，考察了樹參根乙醇提取物及其不同極性萃取部位(石油醚、乙酸乙酷、正丁醇及水部位)的C OX-2抑制活性，結(jié)果表明樹參根乙醇提取物具有很強(qiáng)的COX-2抑制作用，其目標(biāo)抑制劑主要富集在乙酸乙酷和正丁醇萃取部位，它們的半數(shù)抑制濃度(ICso值)分別為77.2士4.2 , 40.7士3._5和28.6士1.9} g/mL。此外，采用AUF-LC-MS技術(shù)快速鑒定了樹參根乙醇提取物及其乙酸乙酷和正丁醇萃取部位中的C OX-2抑制劑，分別鑒定了9, 9和11個(gè)綠原酸類成分(屬苯丙素類，共13個(gè))，表明苯丙素類成分是樹參根抑制C OX-2的主要活性成分群。
　　(4)樹參根抗RA的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
　　采用多種柱色譜技術(shù)，從樹參根的有效部位(乙酸乙酷和正丁醇萃取部位)中共分離并鑒定了34個(gè)目標(biāo)單體化合物(1-34)，包括20個(gè)苯丙素類(1-20), 11個(gè)簡單酚類(21-31)和3個(gè)其它類(32-34)。其中，新化合物1個(gè)(1)，首次從五加科、樹參屬及樹參植物中分離得到的化合物分別有18 , _5和1個(gè)。
　　(5)樹參根通過抑制NF-oB , Akt和JNK信號通路阻抑炎癥反應(yīng)達(dá)到抗RA的作用。
　　采用COX-2試劑盒、1,1一二苯基一2一三硝基苯脅C DPPH)法及TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞模型，評價(jià)了34個(gè)目標(biāo)單體化合物的抗RA作用。結(jié)果表明，化合物6-8,14-21和27具有很強(qiáng)的COX-2抑制活性，它們的ICso值均小于20 }M;化合物15-21具有很強(qiáng)的抗氧化作用，優(yōu)于陽性藥維生素C ( ICso = 33.9士1.1 }M);化合物1, 13,28和30對TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞釋放的一氧化氮(NO ) , IL-2 , IL,-6 , IL,-8和干擾素y ( IFN-們具有很強(qiáng)的抑制作用。此外，化合物1, 13, 28和30在10 }M濃度下，對 TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子一kappa B C NF-KB )、蛋白激酶B (Akt),c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路具有顯著的抑制作用。
　　本文的研究結(jié)果不僅可闡明樹參根抗RA的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，還可為天然來源抗RA藥物的研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的先導(dǎo)化合物，并為其它抗RA中草藥的物質(zhì)基礎(chǔ)快速靶向篩選提供了范例。
　　關(guān)鍵詞:樹參根;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;親和超濾偶聯(lián)色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);環(huán)氧化