比較不同血清型AAV攜帶HBV基因組建立乙肝小鼠模型效果

發(fā)布時(shí)間：

2022-03-25

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研究比較了除 AAV8 之外的其他 4 種血清型重組腺相關(guān)病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）建立乙肝小鼠模型效果

　　摘要∶
　　近年來，用8型腺相關(guān)病毒攜帶1.3拷貝 HBV（Hepatitis Bvirus）基因組建立的HBV持續(xù)感染小鼠模型受到越來越多的關(guān)注。本研究比較了除 AAV8 之外的其他 4 種血清型重組腺相關(guān)病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）建立乙肝小鼠模型效果。
　　首先，將攜帶1.3拷貝 ayw 亞型HBV基因組的1型、2型、5型、8型、9型腺相關(guān)病毒分別以1×10'vg/只（Viral genome，vg）的劑量尾靜脈注射C57BL/6J小鼠;利用 ELISA 方法監(jiān)測(cè)小鼠血清中HBeAg 和HBsAg 表達(dá)水平;用定量PCR方法檢測(cè)小鼠血清和肝臟中 HBV DNA 拷貝數(shù);用免疫組化方法檢測(cè)小鼠肝臟中 HBcAg 的表達(dá);用 HE 染色檢測(cè)小鼠肝臟病理變化。結(jié)果顯示，在持續(xù)8周中，5組小鼠血清中都檢測(cè)到HBeAg 和 HBsAg 的表達(dá)，血清和肝臟中均檢測(cè)到HBV DNA的存在。HBeAg、HBsAg、HBVDNA 表達(dá)水平高低依次為 AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。5 組小鼠用免疫組化方法都檢測(cè)到肝臟中 HBcAg 表達(dá)，HE 染色病理檢測(cè)均觀察到不同程度的肝損傷。本研究擴(kuò)大了能用于建立乙肝小鼠持續(xù)感染模型可選擇的AAV載體種類，發(fā)現(xiàn)雖然 AAV1、2、5、9的建模效果不如 AAV8，但它們都可以介導(dǎo)建立持續(xù)感染的乙肝小鼠模型，建模效果依次為 AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。其中 AAV9 介導(dǎo)的建模效果與 AAV8 載體最為接近，可以替代 AAV8載體用于有效地建立 HBV持續(xù)感染的小鼠模型。
　　關(guān)鍵詞∶動(dòng)物模型，乙型肝炎病毒，AAV小鼠模型，持續(xù)感染
　　乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴俟δ苷系K的傳染病。世界范圍內(nèi)曾感染過HBV的人數(shù)約為20億，慢性 HBV感染者有3.5億，每年約有 100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌（Hepatocellular carcinama，HCC）1。建立 HBV感染的動(dòng)物模型，對(duì)于探索乙肝感染發(fā)病機(jī)制、研究和篩選乙肝藥物、尋找有效的防治方法，具有重要的意義。
　　HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型一直是研究乙肝致病、致癌機(jī)制及抗 HBV藥物研究的重要工具【2-6】。但是，這種模型存在明顯缺陷。其一，由于 HBV基因組DNA是整合于模型鼠染色體中的，而不是存在于染色體外的ccDNA（Covalently closed circular DNA）形式【，與HBV病毒在人體肝臟的感染狀況和復(fù)制模式有明顯差異;其二，模型動(dòng)物之間 HBV 抗原表達(dá)水平和血液中的HBV病毒載量的個(gè)體差異較大。因此有必要建立更好的HBV感染動(dòng)物模型。
　　2010 年董小巖研究組利用攜帶 1.3 拷貝HBV基因組的8型腺相關(guān)病毒（rAAV8-1.3HBV）成功建立了一種持續(xù)感染的HBV小鼠模型，并廣泛應(yīng)用于各種研究中【8-11】。該模型不僅成模效率高，HBV感染維持時(shí)間長(zhǎng)，而且具有可在肝細(xì)胞中形成類似 HBV cccDNA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，為HBV 持續(xù)感染機(jī)制與抗病毒藥物篩選等研究提供了新的動(dòng)物模型。
　　AAV8可用于建立持續(xù)感染的 HBV 小鼠模型，但未曾有報(bào)道除AAV8以外其他血清型AAV 載體是否也能建立 HBV小鼠模型，以及建模的效果。為此，本研究制備 rAAV1-1.3HBV、
　　rAAV2-1.3HBV、rAAV5-1.3HBV、rAAV8-1.3HBV、rAAV9-1.3HBV等5種病毒攜帶1.3個(gè)拷貝HBV 基因組的不同血清型 AAV病毒，通過尾靜脈注射至免疫功能正常的 C57BL/6J小鼠，研究除AAV8 外其他血清型 AAV 載體是否能夠建立HBV 小鼠模型，若能建立 HBV 小鼠模型，則進(jìn)一步比較各組小鼠建模的效果。