兩種復(fù)合模型符合乙肝肝纖維化模型需求 其差異主要集中于病毒學(xué)指標以及病理改變
發(fā)布時間：
2022-03-25
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兩種乙肝肝纖維化小鼠復(fù)合模型的比較
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝性 DNA病毒，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化與肝癌t1-2。建立穩(wěn)定的 HBV 誘導(dǎo)的慢性肝炎肝纖維化動物模型對于乙肝肝纖維化病理機制及其藥物評價具有重要意義。本研究采用C57BL/6 NTg （1.28HBV）/Vst 乙肝病毒轉(zhuǎn)基因（HBV-Tg）與rAAV84.3HBV腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染（rAAV）小鼠，聯(lián)合CCl。腹腔注射，誘導(dǎo)慢性乙肝肝纖維化發(fā)生。觀察比較兩種模型的病毒學(xué)及纖維化病理特點，為研究時選擇相關(guān)動物模型提供依據(jù)。
目的
采用 C57BL/6 N-Tg（1.28HBV）/Vst 型乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠與rAAV8-1.3HBV 腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠聯(lián)合CCl腹腔注射誘導(dǎo)乙肝肝纖維化小鼠模型，比較兩種小鼠模型的病毒學(xué)及生化病理特點。方法實驗分野生型對照組（WT）、rAAV8-.3HBV 轉(zhuǎn)染組（rAAV）、CCl，組（CCl）、rAAV8-.3HBV 復(fù)合 CCL，模型組（rAAV+CCl），C57BL/6 N-Tg（1.28HBV）/Vst 乙肝病毒轉(zhuǎn)基因組（Tg）、轉(zhuǎn)基因復(fù)合 CCl，組（Tg+CCl。），共計造模12周。ELISA試劑盒測定血清 HBsAg、HBeAg水平，熒光定量PCR法檢測血清 HBV-DNA 載量，肝組織石蠟切片免疫組化染色觀察肝內(nèi) HBsAg 及HBcAg 的表達，生化試劑盒測定血清 ALT、AST、AKP，鹽酸水解法檢測肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量。HE 染色及天狼星紅染色觀察炎癥與膠原等病理變化。
結(jié)果
1.兩種復(fù)合模型小鼠血清病毒學(xué)指標比較
結(jié)果顯示∶除 WT組、CCl。組外，其余組血清HBsAg、HBeAg均為陽性，兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組血清HBsAg和HBeAg 水平高于rAAV+CCl。組（P< 0.01、P<0.05）（圖1A、1B）。PCR結(jié)果顯示，除WT組、CCl。組外，其余組別血清 HBV-DNA 載量均高于1.0×10'Ⅲ/mL，rAAV組與rAAV+CCl。組HBV-DNA載量高于 Tg 組與Tg+CCl。組（P<0.01、P<0.05）（圖1C）。
2.兩種復(fù)合模型小鼠肝組織免疫組化染色指標比較
肝組織石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示，WT 組、CCl。組均未見 HBsAg、HBcAg 陽性表達，其余組別小鼠肝組織中HBsAg 和 HBcAg 均可見不同程度陽性表達（圖2A）;通過圖片半定量分析后發(fā)現(xiàn)，rAAV 組較 Tg 組 HBsAg 陽性表達面積明顯減少（P<0.01），而rAAV組較Tg 組肝細胞核 HBcAg 陽性數(shù)量明顯增多（P<0.01）;兩種復(fù)合模型組相比，HBsAg在肝組織中的表達未見明顯差異（P>
3.兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化生化學(xué)指標的比較
血清生化檢測結(jié)果顯示（表1），與WT組比較，CCl復(fù)合造模12周后，CCl組、Tg+CCl，組與rAAV +CCl。組血清 ALT與 AST水平均明顯上升（P<0.01），Tg組與rAAV組對比 WT組沒有明顯變化（P> 0.05）。Tg組與rAAV組 ALT水平具有差異（P<0.01）。兩種復(fù)合模型組相比;Tg+CCl，組與rAAV+CCl4組 ALT、AST水平均未見顯著差異（P>0.05）;各組AKP水平均未見明顯差異（P>0.05）。肝組織Hyp 含量檢測結(jié)果顯示，與WT組比較，CCl。復(fù)合造模 12周后，CCl，組、Tg+CCl組與rAAV+CCl組肝組織中Hyp 含量均顯著升高（P<0.01），兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組對比 rAAV+CCl。組肝內(nèi)Hyp 含量具有明顯差異（P<0.01）。
4.兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化病理特點的比較
HE 染色結(jié)果顯示，WT組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細胞呈條索狀排列整齊，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，Tg組與rAAV組肝小葉排列整齊，僅可觀察到肝細胞核增大，其中rAAV 組存在少量炎細胞浸潤，CCl。組、rAAV+CCl。組、Tg+CCl。組均出現(xiàn)大量肝實質(zhì)細胞壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯氣球樣變和脂肪變，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，WT組肝組織未見明顯膠原沉積，Tg組和rAAV組匯管區(qū)及小葉間出現(xiàn)少量膠原沉積，呈細線狀，未見明顯的橋接和假小葉，CCl組、rAAV+CCl組、Tg+CCl。組肝組織出現(xiàn)明顯膠原纖維沉積，由匯管區(qū)向周圍延伸，形成纖維間隔，其中Tg+CCl。組可見到明顯的假小葉形成（圖3A）。通過膠原半定量分析后發(fā)現(xiàn);Tg+CCl 組膠原含量高于rAAV+CCl，組（P<0.01）（圖3B）。
結(jié)論
兩種復(fù)合模型符合乙肝肝纖維化模型需求，其差異主要集中于病毒學(xué)指標以及病理改變。rAAV+CCl組在 HBV-DNA 載量上具有優(yōu)勢，Tg+CCl組在纖維化進展更為明顯。
【關(guān)鍵詞】動物模型;乙型肝炎病毒;炎癥;肝纖維化;病理學(xué)
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