BMSCs在視網(wǎng)膜脫離動物模型體內(nèi)及低氧培養(yǎng)的661W小鼠視網(wǎng)膜感光細胞中所發(fā)揮的保護作用及其機制
發(fā)布時間：
2022-03-29
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661W小鼠視網(wǎng)膜感光細胞感光細胞損傷可發(fā)生于視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜光損傷、眼外傷等疾病中，其不可逆性損傷可導(dǎo)致視功能的嚴重受損，甚至導(dǎo)致盲的發(fā)生。其中視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment, RD)是最常見的嚴重威脅視力的疾病之一，發(fā)生于視網(wǎng)膜全層裂孔、玻璃體視網(wǎng)膜牽拉或者視網(wǎng)膜下滲出等情況而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮的分離，從而導(dǎo)致光感受器細胞失去代謝和營養(yǎng)支持而發(fā)生損傷。由于視網(wǎng)膜脫離過程中涉及到的光感受器細胞死亡受到多種信號途徑相互作用影響，同時伴有膠質(zhì)細胞增生、視網(wǎng)膜三級神經(jīng)元激活及重塑等過程，因此單一針對某條通路展開治療不能達到完全控制細胞凋亡并保持視網(wǎng)膜完整性的目的。
骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在眼科多種疾病治療中己開展了廣泛的研究，如角膜緣干細胞缺乏、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、缺血及視神經(jīng)損傷等，己被證實具有分化為神經(jīng)樣細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞及光感受器細胞的潛能，同時能夠表達多種細胞因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子，同時抑制局部炎癥反應(yīng)改善視網(wǎng)膜微環(huán)境，減少視網(wǎng)膜細胞凋亡;修復(fù)RPE細胞，保護視網(wǎng)膜外屏障，并可能活化視網(wǎng)膜干細胞。
因此，本研究擬探討B(tài)MSCs在視網(wǎng)膜脫離動物模型體內(nèi)及低氧培養(yǎng)的視錐細胞系661w細胞中所發(fā)揮的保護作用及其機制。
方法
1.體外實驗探討B(tài)MSCs對661w細胞的保護作用及機制
(1)利用低氧培養(yǎng)法制備細胞損傷模型，觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測低氧不同時長后細胞活力改變，同時利用AnnexinV-PI法、線粒體膜電位檢測及caspase-3表達等方法檢測細胞凋亡情況，利用Western blot、酸性囊泡標記物觀察低氧后細胞自噬情況;同時低氧處理前1h加入自噬抑制劑3_MA，觀察細胞活力、凋亡及自噬的變化;
(2)利用transwell培養(yǎng)體系將損傷的661w細胞與BMSCs共培養(yǎng)，同樣方法檢測細胞活力、凋亡情況及自噬情況改變。
2.體內(nèi)研究分析BMSCs視網(wǎng)膜保護作用及機制
(1)分離獲得BMSCs原代培養(yǎng)并進行鑒定;
(2)制備視網(wǎng)膜脫離大鼠模型，將培養(yǎng)的BMSCs移植入視網(wǎng)膜下，觀察移植后視網(wǎng)膜復(fù)位時間段內(nèi)多個時間點視網(wǎng)膜及BMSCs情況;以造模后未進行處理組及視網(wǎng)膜下注射PBS組為對照進行比較;
(3)初步檢測BMSCs對視網(wǎng)膜的保護作用效果:組織切片及HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)及外核層厚度，免疫熒光法及Western blot法檢測視網(wǎng)膜光感受器細胞標記物Rhodopsin表達情況;
(4)研究BMSCs對視網(wǎng)膜保護作用的機制:利用TUNEL法計數(shù)視網(wǎng)膜內(nèi)凋亡細胞數(shù)量，同時Western blot檢測凋亡相關(guān)通路蛋白的表達情況;Westernblot法檢測視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白表達量;
(5 ) BMSCs在眼內(nèi)情況:利用細胞標記試劑盒標記BMSCs后移植到RD模型視網(wǎng)膜下，免疫熒光法檢測移植后的BMSCs在眼內(nèi)移行及分化情況。
結(jié)果
1. 661w細胞低氧培養(yǎng)2h, 4h, 8h, 16h, 24h及48h后，細胞活力發(fā)生不同程度的降低，伴有細胞數(shù)量減少、凋亡數(shù)量增加及細胞形態(tài)異常，同時發(fā)現(xiàn)細胞自噬在低氧后開始增加，低氧8h時達到高峰后降低，利用3-MA抑制細胞自噬后細胞活力下降;
2.與BMSCs共培養(yǎng)的661w細胞形態(tài)較為正常，且活力有所增加，凋亡細胞明顯減少，而共培養(yǎng)時加入自噬抑制劑，即使與BMSCs共培養(yǎng)，細胞活力仍發(fā)生降低的同時凋亡細胞增多;
3.移植BMSCs的視網(wǎng)膜脫離眼中，視網(wǎng)膜外核層厚度更接近正常視網(wǎng)膜，與空白組及對照相相比光感受器細胞較厚及排列較為規(guī)整;
4.移植BMSCs后，早期視網(wǎng)膜外核層內(nèi)凋亡細胞數(shù)量明顯減少，而且Caspase-3,8,9的表達量均較對照減少;
5.移植BMSCs后的短期內(nèi)，視網(wǎng)膜LC-3II表達升高、P62表達降低，視網(wǎng)膜內(nèi)自噬激活;
6.移植干細胞眼內(nèi)沒有觀察到視網(wǎng)膜下移植的BMSCs有明顯的移行整合過程及向視網(wǎng)膜細胞分化的傾向。
結(jié)論
本研究以BMSCs為研究對象，選擇視網(wǎng)膜脫離及細胞低氧培養(yǎng)作為體內(nèi)外實驗?zāi)Ｐ停剿鞲杉毎谄渲邪l(fā)揮的保護作用及可能的部分機制。結(jié)果提示低氧環(huán)境對體外培養(yǎng)的光感受器細胞系661w細胞造成損傷，而早期自噬水平的提高有利于幫助細胞度過低氧應(yīng)激，降低細胞凋亡，保護細胞活力;與BMSCs共培養(yǎng)能夠降低低氧對661w的損傷，減少細胞凋亡，這種保護作用的發(fā)揮在一定程度上是由BMSCs介導(dǎo)的自噬調(diào)控實現(xiàn)的。視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜細胞特別是光感受器細胞發(fā)生了包括凋亡、自噬、壞死、增殖等一系列病理變化，致使視網(wǎng)膜復(fù)位后仍存在光感受器細胞形態(tài)功能不能完全恢復(fù);BMSCs眼內(nèi)移植后能夠明顯減少光感受器細胞死亡，保存視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，其能夠減少視網(wǎng)膜細胞凋亡，并在移植后短期內(nèi)激活視網(wǎng)膜細胞自噬，幫助視網(wǎng)膜細胞度過視網(wǎng)膜脫離后的缺氧及低營養(yǎng)狀態(tài)期。
本實驗觀察BMSCs在光感受器細胞損傷時發(fā)揮的保護作用的同時研究其發(fā)揮作用的機制，一方面可以通過抑制細胞凋亡來減少細胞損失，另一方面可以激活細胞自噬從使細胞在應(yīng)激狀態(tài)中存活。
關(guān)鍵詞:
骨髓間充質(zhì)干細胞，光感受器細胞損傷，視網(wǎng)膜脫離，低氧，凋亡，自噬
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