BCP/PC突變對(duì)慢性HBV乙型小鼠模型表型影響研究

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-12

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細(xì)胞庫(kù)源細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CRO服務(wù)、SCI潤(rùn)色)

作者：

吉妮歐

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慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界上最常見的慢性傳染病之一，可最終導(dǎo)致肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinonma, HCC ) }1-3}

　　研究背景與目的
　　乙型肝炎病毒CHepatitis B virus, HBV)感染是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全世界約有2.48億人感染HB V，其慢性感染可導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的肝臟疾病，包括肝纖維化(fiver fibrosis，肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝細(xì)胞癌C hepatocellular carcinoma , HCC。HB V具有種屬特異性和組織特異性，同時(shí)還具有高復(fù)制和高突變率特性，其常見的基因突變位點(diǎn)為基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子(Basic Core Promoter，BCP)區(qū)的1762 C A1762T)和1764 C G1764A)及前核心(Pre-Core } PC)區(qū)的1896 C G1896A)和1899 C G1899A。體外實(shí)驗(yàn)或臨床樣本研究已發(fā)現(xiàn)，B CP/PC聯(lián)合突變會(huì)阻斷或降低HBeAg表達(dá)，然而，B CP/PC聯(lián)合突變對(duì)HB V表型的更多影響尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期B CP/PC聯(lián)合突變 C B CP/PC C M)乙肝小鼠模型的基礎(chǔ)上，建立回復(fù)突變(B CP/PC C R)慢性乙型HBV小鼠模型，通過(guò)對(duì)比分析研究B CP/PC聯(lián)合突變對(duì)HB V主要標(biāo)志物表型、機(jī)體免疫表型的影響，為臨床診斷和探討B(tài) CP/PC聯(lián)合突變所致的表型變化機(jī)制提供了理論依據(jù)。

　　前言
　　慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界上最常見的慢性傳染病之一，可最終導(dǎo)致肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinonma, HCC ) }1-3}。盡管己有最新的基因工程HB V疫苗和多種抗HB V藥物的開發(fā)和應(yīng)用，但HBV感染仍然是全球主要的健康問(wèn)題之一，全世界大約有2.48億慢性HB V感染患者[[4]0
　　HB V感染機(jī)體后，其基因組由松弛環(huán)狀DNA (relaxed circular DNA, rcDNA)修飾成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA ( Covalently closed circular DNA, cccDNA)的形式存在于感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，cccDNA的持續(xù)存在是HB V不能完全消除以及停藥后復(fù)發(fā)的主要原因f5-81。從肝細(xì)胞中消除cccDNA被認(rèn)為是消除慢性HB V病毒感染的
　　終極目標(biāo)[m。應(yīng)用免疫健全、能表達(dá)ccc DNA、且HB sAg能持續(xù)表達(dá)6個(gè)月的小鼠模型，是進(jìn)行HB V相關(guān)研究的理想模型。
　　HB V具有高復(fù)制和高突變率的特性。最常見的HB V基因組變異包括基本核心啟動(dòng)子(Basic core promoter, BCP)區(qū)ntA1762T/G 1764A雙突變和前核心(Pre-core, PC)區(qū)ntG 1896A/ntG 1899A的終止密碼子突變。目前己知B CP/PC突變可分別阻斷或降低HBeAg的表達(dá)「lo-lay } BCP/PC突變與野生型兩者在CHB的發(fā)病機(jī)
　　理，免疫力，自然臨床過(guò)程，預(yù)后和治療方面存在重大差異[[13' 14]。有研究發(fā)現(xiàn)BCP/PC突變會(huì)顯著增加了CHB患者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)[[15];也有研究表明感染BCP/PC突變病毒的CHB患者比感染BCP/PC野生型病毒的患者更容易發(fā)生重度肝炎和肝功能衰竭，感染PC突變病毒的肝功能衰竭患者死亡風(fēng)險(xiǎn)也更高「16]。在之
　　前的研究中，我們課題組從臨床患者血清中分離并鑒定出BCP/PC ( ntA1762T/G 1764A/G 1896A/G 1899A)聯(lián)合突變、B基因型和adw血清亞型的HB V毒株[ys}。以此毒株DNA為模板在體外合成cccDN A，通過(guò)尾靜脈高壓注射(hydrodynamic injection, HDI)方法建立了一個(gè)模擬HBeAg陰性的C_57BL/6J和CB A/C aJ小鼠模型「17' 18]。然而，這種自然BCP/PC突變毒株除HBeAg缺陷外，對(duì)HB V其它表型是否有影響仍不清楚。由于HB V的表型特性對(duì)于評(píng)估CHB患者的疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)至關(guān)重要「‘”]。因此，在本研究中，我們分別以BCP/PC突變基因序列(BCP/}C CM)和回復(fù)BCP/PC突變位點(diǎn)后的基因序列(BCP/PC CR)
　　為模板，制備并鑒定了BCP/PC CM ) cccDNA和BCP/PC CR ) cccDNA。然后將不同的cccDNA HDI到CBA/CaJ小鼠中，同時(shí)建立BCP/PC (M)和BCP/PC (R)的HB V動(dòng)物模型。通過(guò)對(duì)比分析的方法，精確動(dòng)態(tài)的觀察天然BCP/PC突變對(duì)HB V的表型影響。
　　方法
　　1.應(yīng)用分子生物學(xué)方法制備BCP/PC C R)共價(jià)閉合環(huán)狀DNAC covalently closed circular DNA, cccDNA，并測(cè)序鑒定。
　　2.在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA, ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HB sAg和HBeAg的分泌水平。
　　3.通過(guò)尾靜脈高壓注射的方法將兩種HBV cccDNA和/或生理鹽水分別注射到CBA/CaJ雄性小鼠C 8-10 w)體內(nèi)，于指定時(shí)間點(diǎn)采取血清樣本和小鼠肝臟組織樣本。
　　4.通過(guò)放射免疫法檢測(cè)血清樣本中HB sAg和HBeAg的水平。
　　5.通過(guò)qPCR檢測(cè)小鼠血清和/或肝臟組織中HB V DNA和cccDNA的水平。
　　6.通過(guò)免疫組化檢測(cè)肝臟中HB sAg和HBcAg的蛋白質(zhì)水平。
　　7.通過(guò)RT qPCR檢測(cè)肝臟中IL-1p，IL-4, IL-6和IL-10的mRNA水平。
　　8.通過(guò)HE染色檢測(cè)肝臟病理變化。
　　9.通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析肝臟和血清中HB V標(biāo)志物的相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1.酶切及測(cè)序結(jié)果表明B CP/PC C R ) cccDNA構(gòu)建成功。
　　2.在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染BCP/PC CM) cccDNA和B CP/PC C R ) cccDNA o B CP/PC C M ) cccDNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中未檢測(cè)到HBeAg，且HB sAg的水平明顯低于BCP/PC CM)組(p<0.05 > o
　　3. CBA/CaJ小鼠分別注射BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA后，兩種小鼠中HB V標(biāo)志物(HBsAg, HBeAg, HBV DNA和cccDNA)均可持續(xù)表達(dá)26周以上。
　　4.在感染早期，BCP/PC CM)組小鼠血清中HB sAg和HB V DNA的水平以及肝臟中HB V DNA和cccDNA的水平均顯著低于B CP/PCCR)組(p<0.05;在整個(gè)感染期，BCP/PC CM)組小鼠血清中ALT的水平明顯高于BCP/PC CR)組(p<0.05。與BCP/PC C R)組相比，感染4周后，B CP/PC C M)組肝臟中IL-4和IL-10的mRNA水平顯著
　　降低;然而，感染26周后，B CP/PC C M)組肝臟中IL-4和IL-10的mRNA水平顯著升高，IL-1p的mRNA水平顯著降低。
　　5.感染26周后，兩組小鼠肝臟均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，且B CP/PC C M)組的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少于BCP/PC C R)組。
　　6.在兩組小鼠中，血清中HB V DNA的水平與肝細(xì)胞內(nèi)HB V DNA和cccDNA的水平均呈顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.成功回復(fù)突變構(gòu)建了B CP/PC C R ) cccDNA，并建立了B CP/PCCM)和BCP/pC CR)慢性乙型肝炎小鼠模型。B CP/PC C R)組小鼠血清HBeAg的表達(dá)持續(xù)陽(yáng)性，兩組小鼠中的HB V標(biāo)志物均能穩(wěn)定表達(dá)26w以上。
　　2. BCP/PC突變導(dǎo)致小鼠感染早期血清及肝臟中HB V標(biāo)志物水平降低，以及整個(gè)感染周期血清中ALT水平升高。
　　3.血清中HB V DNA水平比HB sAg更好地反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制程度和cccDNA拷貝數(shù)。
　　4. BCP/PC突變導(dǎo)致小鼠感染后期炎癥反應(yīng)減輕，其機(jī)制可能是在感染早期，B CP/PC突變抑制小鼠肝臟中Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，而在感染后期，抑制Thl細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　關(guān)鍵詞:B CP/PC突變，表型，慢性乙型肝炎，小鼠模型，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA