HBV感染小鼠與土撥鼠模型中特異性免疫應答特征研究
發布時間：
2022-04-13
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目的
1.應用高壓水尾靜脈注射HBV復制小鼠模型，系統比對分析急、慢性HBV感染模型中特異性免疫應答特點差異。
2.應用土撥鼠WHV感染模型，研究土撥鼠T細胞抑制性受體分子Tim-3及其配體Gal-9 (Galectin-9)分子特點及其在WHV不同感染狀態下分子表達特點。
方法
1.應用高壓水注射pSM2, pAAV/HBV 1.2質粒分別建立急性自限性HBV小鼠模型(Acute-resolving mouse, ARM)和慢性HBV肝內復制小鼠模型(Persistent replication mouse, PRM);ELISA (Enzyme linked immunosorbentassay)檢測ARM和PRM血清中病毒標志物HBsAg, HBeAg表達水平;FAC S(Fluorescence-activated cell sorting)檢測質粒注射后不同時I旬點ARM和PRM外周和肝臟中:
①主要特異性免疫應答細胞頻率的動態變化及差異;
②CDB+T, CD4+ T細胞表面活化及抑制性受體分子表達的動態變化及差異;
③APC細胞(Antigen presenting cell)表型動態變化特點及差異;④肝內HBV特異性T細胞內因子IFN-y, TNF-a和IL-2的分泌。
2.應用土撥鼠模型，克隆Tim-3和Gal-9分子并分析其分子特點，應用RT-qPCR(Reverse Transcription Real Time Quantitative Polymerase China Reaction)檢測其組織表達，以及Gal-9分子在WHV不同感染狀態下的表達情況;制備土撥鼠Tim-3分子多克隆抗體，并應用WB (Western blot)和FACS (Fluorescenceactivated cell sorting)鑒定其功能。
結果
一、急、慢性HBV復制小鼠中特異性免疫細胞頻率動態變化及比對分析:
1.CDB+T細胞:HBV質粒注射后第4天(4dpi, 4 days post injection)在ARM和PRM中均增多，7dpi在ARM外周血中增多，21 dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒有此現象;
2.HBV特異性CDB+ T細胞:4-7即i在ARM中增多，21 dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒有此現象
3.DC細胞(Dendritic cells )4即i在ARM脾臟中增多，7dpi在ARM外周血中增多，14dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒有此現象;
4.CD4+T細胞:4即i在ARM和PRM脾臟中增多5.B細胞:21 dpi在ARM外周血中特異性增多;)MC細胞(Myeloidcells ) :21 dpi在PRM肝內特異性增高;
二、急、慢性HBV復制小鼠中CD4+和CDB+ T細胞活化表型的動態變化及比對分析:
1.CDB+ T細胞活化表型:ARM小鼠脾臟、外周血及肝臟中CDB+ T細胞活化表型CD44表達較PRM增高，抑制性表型CD62L表達較PRM降低;
2.CD4+ T細胞活化表型:ARM脾臟、外周血及肝臟中CD4十T細胞活化表型CD44表達較PRM增高，抑制性表型CD62L表達較PRM降低。
三、CD8十T細胞功能檢測:HI后21 dpi ARM肝內HBV抗原特異性CDB+ T細胞分泌細胞因子的能力較PRM增強。
四、急、慢性HBV復制小鼠中APC細胞(Antigen presenting cells)表面分子PD-L1(Programmed death ligand 1)、MHCI (Major Histocompatibility Complex I)動態變化及比對分析:
1.DC細胞MHCI表達:21 dpi在ARM肝臟中增多;
2.MC細胞MHCI表達:14dpi在ARM脾臟中增多;14dpi在PRM肝臟中增多，21 dpi在ARM小鼠肝臟中增多;
3.PD-L 1: DC細胞PD-L 1表達:7dpi在PRM脾臟中增多;21 dpi在PRM肝臟中增多;
4.MC細胞PD-L 1表達:21 dpi在PRM脾臟中增多;21 dpi在ARM肝臟中增多;
五、獲得土撥鼠Tim-3分子576bp胞外段序列，Gal-9分子全長CDS區序列，相似性比對分析發現土撥鼠Tim-3 , Gal-9分子與地松鼠相似性最高，其氨基酸水平相似性分比為97%和98%;
六、Tim-3分子mRNA在土撥鼠各器官組織中表達由高到底依次為大腸、脾、肺、心臟、小腸、脂肪、翠丸，而肌肉、腎臟與肝臟中未檢測到;Gal-9分子mRNA在土撥鼠各器官組織中高到底依次為翠丸、’腎、肝臟、大腸、心臟、肌肉、脾臟、小腸、脂肪、腎臟;
七、Gal-9分子mRNA在WHV慢性感染土撥鼠肝臟組織中表達升高，而在急性感染土撥鼠肝組織中表達降低;
八、制備兔抗土撥鼠Tim-3多克隆抗體，1:500效價用來WB (Western Blot)檢測土撥鼠Tim-3分子的表達;1:50效價可用來流式檢測土撥鼠PBMC細胞( Peripheral blood mononuclear cells)中Tim-3分子的表達。
結論
1.急、慢性HBV復制小鼠中特異性免疫的主要免疫細胞頻率存在差異:
①ARM和PRM早期脾臟中均存在CDB+ T細胞的致敏增殖，但PRM外周致敏的T細胞不能被募集至肝臟發揮抗病毒效應;
②HBV抗原特異性CD8+T細胞僅在ARM肝臟中增殖，而PRM肝臟中無病毒特異性T細胞聚集;
③ARM中DC細胞早期在脾臟中增殖，隨之在外周血中升高，后期肝臟內升高的現象，而PRM中無此現象，提示PRM中DC細胞增殖能力差。
2.急、慢性HBV復制小鼠中T細胞活化表型及功能存在差異:
①ARM脾臟、外周血和肝臟中T細胞表面受體分子表達與PRM相比，活化性受體表達升高，抑制性受體表達降低，提示PRM中T細胞活化障礙;
②ARM肝內HBV特異性CDB+ T細胞殺傷功能較PRM明顯增強。
3.急、慢性HBV復制小鼠中APC細胞表面分子表達存在差異:PRM肝內DC細胞感染后期表達PD-L 1升高，提示PRM中可能存在DC細胞功能耗竭;
4.獲得土撥鼠Tim-3部分胞外段以及Gal-9全長編碼序列。
5. Tim-3分子在土撥鼠大腸組織中表達最高，罕丸組織中最低;Gal-9分子在各組織器官中表達廣泛，其在寒丸組織中表達最高，在腎臟組織中最低;
6.土撥鼠不同WHV感染狀態下Gal-9的表達情況存在差異。
7.成功制備了Tim-3胞外段多兔抗土撥鼠多克隆抗體，該抗體有較高的效價和特異性，能夠用于WB和FACS的檢測。
本研究的創新點和意義
1.首次利用小鼠HBV復制模型，系統比對分析了HBV急、慢性復制過程中，外周及肝內特異性免疫免疫應答特征的差異，包括特異性免疫細胞的頻率、T細胞及APC細胞活化/抑制表型、T細胞功能的動態變化;
研究首次發現在HBV慢性復制小鼠中，也存在早期外周免疫器官(脾臟)中CDB+ T細胞的致敏增殖，但增殖的細胞不能同ARM中一樣，能夠被有效募集至肝臟發揮抗病毒作用，為CDB+ T細胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的線索。
本研究首次克隆土撥鼠Tim-3和Gal-9分子序列，同時檢測了Tim-3和Gal-9分子在土撥鼠不同組織中表達情況以及不同 WHV感染狀態下Gal-9分子的表達情況并進行分析。
首次制備抗土撥鼠Tim-3多克隆抗體，可以用來檢測Tim-3蛋白在的表達。
關鍵詞:乙肝病毒、異性免疫應答、小鼠高壓水HBV模型、土撥鼠WHV感染模型、Tim-3分子、Gal-9分子
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