HBV感染小鼠與土撥鼠模型中特異性免疫應(yīng)答特征研究

發(fā)布時(shí)間：

2022-04-13

來(lái)源：

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作者：

吉妮歐

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研究首次發(fā)現(xiàn)在HBV慢性復(fù)制小鼠中，也存在早期外周免疫器官(脾臟)中CDB+ T細(xì)胞的致敏增殖，但增殖的細(xì)胞不能同ARM中一樣，能夠被有效募集至肝臟發(fā)揮抗病毒作用，為CDB+ T細(xì)胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的線索

　　目的
　　1.應(yīng)用高壓水尾靜脈注射HBV復(fù)制小鼠模型，系統(tǒng)比對(duì)分析急、慢性HBV感染模型中特異性免疫應(yīng)答特點(diǎn)差異。
　　2.應(yīng)用土撥鼠WHV感染模型，研究土撥鼠T細(xì)胞抑制性受體分子Tim-3及其配體Gal-9 (Galectin-9)分子特點(diǎn)及其在WHV不同感染狀態(tài)下分子表達(dá)特點(diǎn)。
　　方法
　　1.應(yīng)用高壓水注射pSM2, pAAV/HBV 1.2質(zhì)粒分別建立急性自限性HBV小鼠模型(Acute-resolving mouse, ARM)和慢性HBV肝內(nèi)復(fù)制小鼠模型(Persistent replication mouse, PRM);ELISA (Enzyme linked immunosorbentassay)檢測(cè)ARM和PRM血清中病毒標(biāo)志物HBsAg, HBeAg表達(dá)水平;FAC S(Fluorescence-activated cell sorting)檢測(cè)質(zhì)粒注射后不同時(shí)I旬點(diǎn)ARM和PRM外周和肝臟中:
　　①主要特異性免疫應(yīng)答細(xì)胞頻率的動(dòng)態(tài)變化及差異;
　　②CDB+T, CD4+ T細(xì)胞表面活化及抑制性受體分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及差異;
　　③APC細(xì)胞(Antigen presenting cell)表型動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)及差異;④肝內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞內(nèi)因子IFN-y, TNF-a和IL-2的分泌。
　　2.應(yīng)用土撥鼠模型，克隆Tim-3和Gal-9分子并分析其分子特點(diǎn)，應(yīng)用RT-qPCR(Reverse Transcription Real Time Quantitative Polymerase China Reaction)檢測(cè)其組織表達(dá)，以及Gal-9分子在WHV不同感染狀態(tài)下的表達(dá)情況;制備土撥鼠Tim-3分子多克隆抗體，并應(yīng)用WB (Western blot)和FACS (Fluorescenceactivated cell sorting)鑒定其功能。
　　結(jié)果
　　一、急、慢性HBV復(fù)制小鼠中特異性免疫細(xì)胞頻率動(dòng)態(tài)變化及比對(duì)分析:
　　1.CDB+T細(xì)胞:HBV質(zhì)粒注射后第4天(4dpi, 4 days post injection)在ARM和PRM中均增多，7dpi在ARM外周血中增多，21 dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒(méi)有此現(xiàn)象;
　　2.HBV特異性CDB+ T細(xì)胞:4-7即i在ARM中增多，21 dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒(méi)有此現(xiàn)象
　　3.DC細(xì)胞(Dendritic cells )4即i在ARM脾臟中增多，7dpi在ARM外周血中增多，14dpi在ARM肝臟中增多，而PRM中則沒(méi)有此現(xiàn)象;
　　4.CD4+T細(xì)胞:4即i在ARM和PRM脾臟中增多5.B細(xì)胞:21 dpi在ARM外周血中特異性增多;)MC細(xì)胞(Myeloidcells ) :21 dpi在PRM肝內(nèi)特異性增高;
　　二、急、慢性HBV復(fù)制小鼠中CD4+和CDB+ T細(xì)胞活化表型的動(dòng)態(tài)變化及比對(duì)分析:
　　1.CDB+ T細(xì)胞活化表型:ARM小鼠脾臟、外周血及肝臟中CDB+ T細(xì)胞活化表型CD44表達(dá)較PRM增高，抑制性表型CD62L表達(dá)較PRM降低;
　　2.CD4+ T細(xì)胞活化表型:ARM脾臟、外周血及肝臟中CD4十T細(xì)胞活化表型CD44表達(dá)較PRM增高，抑制性表型CD62L表達(dá)較PRM降低。
　　三、CD8十T細(xì)胞功能檢測(cè):HI后21 dpi ARM肝內(nèi)HBV抗原特異性CDB+ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力較PRM增強(qiáng)。
　　四、急、慢性HBV復(fù)制小鼠中APC細(xì)胞(Antigen presenting cells)表面分子PD-L1(Programmed death ligand 1)、MHCI (Major Histocompatibility Complex I)動(dòng)態(tài)變化及比對(duì)分析:
　　1.DC細(xì)胞MHCI表達(dá):21 dpi在ARM肝臟中增多;
　　2.MC細(xì)胞MHCI表達(dá):14dpi在ARM脾臟中增多;14dpi在PRM肝臟中增多，21 dpi在ARM小鼠肝臟中增多;
　　3.PD-L 1: DC細(xì)胞PD-L 1表達(dá):7dpi在PRM脾臟中增多;21 dpi在PRM肝臟中增多;
　　4.MC細(xì)胞PD-L 1表達(dá):21 dpi在PRM脾臟中增多;21 dpi在ARM肝臟中增多;
　　五、獲得土撥鼠Tim-3分子576bp胞外段序列，Gal-9分子全長(zhǎng)CDS區(qū)序列，相似性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)土撥鼠Tim-3 , Gal-9分子與地松鼠相似性最高，其氨基酸水平相似性分比為97%和98%;
　　六、Tim-3分子mRNA在土撥鼠各器官組織中表達(dá)由高到底依次為大腸、脾、肺、心臟、小腸、脂肪、翠丸，而肌肉、腎臟與肝臟中未檢測(cè)到;Gal-9分子mRNA在土撥鼠各器官組織中高到底依次為翠丸、’腎、肝臟、大腸、心臟、肌肉、脾臟、小腸、脂肪、腎臟;
　　七、Gal-9分子mRNA在WHV慢性感染土撥鼠肝臟組織中表達(dá)升高，而在急性感染土撥鼠肝組織中表達(dá)降低;
　　八、制備兔抗土撥鼠Tim-3多克隆抗體，1:500效價(jià)用來(lái)WB (Western Blot)檢測(cè)土撥鼠Tim-3分子的表達(dá);1:50效價(jià)可用來(lái)流式檢測(cè)土撥鼠PBMC細(xì)胞( Peripheral blood mononuclear cells)中Tim-3分子的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　1.急、慢性HBV復(fù)制小鼠中特異性免疫的主要免疫細(xì)胞頻率存在差異:
　　①ARM和PRM早期脾臟中均存在CDB+ T細(xì)胞的致敏增殖，但PRM外周致敏的T細(xì)胞不能被募集至肝臟發(fā)揮抗病毒效應(yīng);
　　②HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞僅在ARM肝臟中增殖，而PRM肝臟中無(wú)病毒特異性T細(xì)胞聚集;
　　③ARM中DC細(xì)胞早期在脾臟中增殖，隨之在外周血中升高，后期肝臟內(nèi)升高的現(xiàn)象，而PRM中無(wú)此現(xiàn)象，提示PRM中DC細(xì)胞增殖能力差。
　　2.急、慢性HBV復(fù)制小鼠中T細(xì)胞活化表型及功能存在差異:
　　①ARM脾臟、外周血和肝臟中T細(xì)胞表面受體分子表達(dá)與PRM相比，活化性受體表達(dá)升高，抑制性受體表達(dá)降低，提示PRM中T細(xì)胞活化障礙;
　　②ARM肝內(nèi)HBV特異性CDB+ T細(xì)胞殺傷功能較PRM明顯增強(qiáng)。
　　3.急、慢性HBV復(fù)制小鼠中APC細(xì)胞表面分子表達(dá)存在差異:PRM肝內(nèi)DC細(xì)胞感染后期表達(dá)PD-L 1升高，提示PRM中可能存在DC細(xì)胞功能耗竭;
　　4.獲得土撥鼠Tim-3部分胞外段以及Gal-9全長(zhǎng)編碼序列。
　　5. Tim-3分子在土撥鼠大腸組織中表達(dá)最高，罕丸組織中最低;Gal-9分子在各組織器官中表達(dá)廣泛，其在寒丸組織中表達(dá)最高，在腎臟組織中最低;
　　6.土撥鼠不同WHV感染狀態(tài)下Gal-9的表達(dá)情況存在差異。
　　7.成功制備了Tim-3胞外段多兔抗土撥鼠多克隆抗體，該抗體有較高的效價(jià)和特異性，能夠用于WB和FACS的檢測(cè)。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)和意義
　　1.首次利用小鼠HBV復(fù)制模型，系統(tǒng)比對(duì)分析了HBV急、慢性復(fù)制過(guò)程中，外周及肝內(nèi)特異性免疫免疫應(yīng)答特征的差異，包括特異性免疫細(xì)胞的頻率、T細(xì)胞及APC細(xì)胞活化/抑制表型、T細(xì)胞功能的動(dòng)態(tài)變化;
　　研究首次發(fā)現(xiàn)在HBV慢性復(fù)制小鼠中，也存在早期外周免疫器官(脾臟)中CDB+ T細(xì)胞的致敏增殖，但增殖的細(xì)胞不能同ARM中一樣，能夠被有效募集至肝臟發(fā)揮抗病毒作用，為CDB+ T細(xì)胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的線索。
　　本研究首次克隆土撥鼠Tim-3和Gal-9分子序列，同時(shí)檢測(cè)了Tim-3和Gal-9分子在土撥鼠不同組織中表達(dá)情況以及不同 WHV感染狀態(tài)下Gal-9分子的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
　　首次制備抗土撥鼠Tim-3多克隆抗體，可以用來(lái)檢測(cè)Tim-3蛋白在的表達(dá)。
　　關(guān)鍵詞:乙肝病毒、異性免疫應(yīng)答、小鼠高壓水HBV模型、土撥鼠WHV感染模型、Tim-3分子、Gal-9分子